液相色谱-高分辨率质谱联用技术：通过烷基胺的氢键作用分析完整的核糖核酸

《Journal of Chromatography A》：Liquid chromatography - high resolution mass spectrometry analysis of intact ribonucleic acid through hydrogen bonding of alkylamines

本研究通过量子化学软件Orca 6.0模拟胺类试剂与合成寡核苷酸中核苷酸的氢键结合，结合IPRP-LC-MS实验验证，发现增加寡核苷酸疏水性可促进其气相转移，提升检测灵敏度，成功分析出含量低于5%的杂质，并证实无需氟代乙醇即可实现单同位素质谱确认。

　　

罗伯特·L·罗斯 | J·迈克尔·萨顿 | 基利·墨菲 | 罗伯托·加梅斯 | 瑞安·考利 | 林珊华 | 杜敏 | 迈克尔·G·巴特利特

美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技

摘要

核酸寡核苷酸是治疗疾病的一种有前景的方法。这些生物聚合物是通过合成方法生产的，这一过程可能会产生杂质。液相色谱与高分辨率质谱联用是一种用于确定样品纯度的可靠分析技术。传统上，在将样品送入质谱仪之前，会使用离子配对试剂来促进色谱分离，这种方法称为离子配对反相液相色谱质谱（IPRP-LC-MS）。对于IPRP-LC-MS来说，所选试剂的选择会随着测量寡核苷酸长度的增加而影响实验结果。这部分是由于寡核苷酸从液相转变为气相时存在热力学能量障碍。在这项研究中，我们使用量子化学软件包Orca 6.0对二级胺通过氢键与合成寡核苷酸的核碱基之间的理论结合进行了建模。然后，我们通过将IPRP-LC与高分辨率准确质谱（HRAM-MS）联用来验证这些结果。通过增加寡核苷酸的相对疏水性，其转变为气相的过程得到改善，从而提高了检测灵敏度。这使得我们能够检测到相对丰度低于5%的引导RNA杂质。

引言

基于RNA的疗法[1,2]的应用持续增长，随之而来的是对确保这些合成药物质量和疗效的分析方法的需求[3]。基于CRISPR[4]基因编辑的疗法使用的RNA序列比反义[5]或干扰RNA[6]疗法更长。在CRISPR/Cas13[7,8]系统中，特定的引导RNA（sgRNA）[9]长度约为40个核苷酸（nt），而Cas9系统使用的长度为100个nt或更长，并且可以携带多个修饰核苷酸[10,11]。这些寡核苷酸在分析上存在挑战[12]，因为它们是逐个核苷酸合成[13]的，并且在每次添加单体时都会产生大量杂质（“失败序列”）。

离子配对液相色谱与高分辨率准确质谱联用为寡核苷酸分析提供了一个坚实的分析平台，并且几十年来一直有效地用于分离复杂混合物[15],[16],[17]。这种分离的主要机制是烷基胺与具有正电荷表面的疏水固定相之间的插层作用，从而与寡核苷酸的磷酸骨架发生离子相互作用[18]。此外，还发现移动相中的烷基胺会直接与磷酸骨架相互作用，掩盖负电荷，从而增加寡核苷酸的疏水性[19]。

烷基胺/氟醇移动相系统已被证明是一种由多种竞争性化学物质组成的复杂混合物，这些物质会影响色谱保留和电喷雾脱附。色谱保留遵循Guillarme等人[20]所描述的开启-关闭模型。该模型的开启/关闭机制主要受烷基胺的疏水性、烷基胺浓度、柱温、反离子类型和移动相pH值的影响。这一机制最显著的特点是寡核苷酸的序列或组成对其没有影响[21]。这意味着所有长度相同的寡核苷酸会一起洗脱。这一特性使得杂质分析更加依赖于电喷雾电离质谱来根据不同的分子量区分杂质。

使用非烷烃基固定相的离子配对色谱显示出能够与寡核苷酸的两个面发生相互作用。这使得这些固定相能够区分不同组成和序列的寡核苷酸。这一观点得到了涉及苯基[22]和胆固醇[23]固定相的研究的支持，这些固定相除了通过烷基胺介导的离子相互作用外，还展示了与核碱基的复杂π堆叠相互作用。在亲水相互作用色谱中还有新的发现，即核碱基与固定相之间的受体-供体相互作用也是保留的重要因素[24]。

然而，在这项研究之前，这类相互作用在离子配对反相色谱中尚未被观察到。我们发现，在核酸的离子配对反相色谱中使用的烷基胺可以与核碱基形成氢键。添加的疏水性会影响色谱保留，并在LC-MS采样过程中增强电喷雾电离，从而能够对越来越长的寡核苷酸（如IVT mRNA多聚A尾和tRNA[25,26]）进行单同位素质量测量。此外，我们还发现，烷基胺的疏水性增加可以在不需要HFIP的情况下增强LC-MS采样过程中的电喷雾信号。

试剂

N,N-二丁胺、三乙胺、二乙胺、Optima Grade UHPLC级水及乙腈、LC-MS级醋酸铵、醋酸和无DNA/RNase的水均购自赛默飞世尔科技。

样品

未修饰的40聚体RNA、100聚体RNA、聚脱氧腺苷（15聚体）和聚脱氧肌苷（15聚体）通过Integrated DNA Technology购买。

40聚体RNA序列

GGGCCGUGGUGGAGCUGCACACCGCCGACGGCACCCUGA U

100聚体RNA序列

低电荷状态下的DBA和ACN添加

转录和翻译过程中遗传信息的准确性取决于DNA和RNA中核碱基之间的氢键。在沃森-克里克碱基配对过程中，杂环环上的供体和受体原子之间会形成稳定的氢键[27,28]，其中氢键受体位点的数量是供体位点的2:1（图1）。历史上，通过质谱分析核酸时一直采用离子配对色谱进行分离。

结论

在这项研究中，我们发现通过氢键供体胺与核碱基之间的相互作用，可以增强RNA的LC-MS采样效果。这种结合减少了寡核苷酸与水化壳之间的相互作用，使RNA分子更容易从液相转变为气相。通过使用经典的烷基链修饰硅胶上的离子配对方法以及计算建模，我们发现15聚体脱氧肌苷结构中的N3位点被占据

数据可用性

评估论文结论所需的所有数据均包含在论文和/或补充信息中。如需与本文相关的额外数据，可向作者索取。

CRediT作者贡献声明

罗伯特·L·罗斯：撰写 – 审稿与编辑、软件应用。J·迈克尔·萨顿：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据分析、概念化。基利·墨菲：撰写 – 审稿与编辑、软件应用、数据管理。罗伯托·加梅斯：撰写 – 审稿与编辑、软件应用。瑞安·考利：资源协调。林珊华：资源协调。杜敏：监督、资源支持。迈克尔·G·巴特利特：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学、数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢赛默飞世尔科技研究办公室的Karen Nelson博士和Tony Yee对研究的持续支持。同时，我们也感谢FACCTs的Christoph Riplinger和Bernardo de Souza在ORCA软件使用方面的讨论。