利用大蜡螟（Galleria mellonella）作为“Candidatus Liberibacter asiaticus”的短期宿主模型：营养代谢谱与免疫反应研究

为解决柑橘黄龙病（HLB）病原体“Candidatus Liberibacter asiaticus”（Ca. L. asiaticus）难以纯培养的问题，研究人员开展利用大蜡螟（Galleria mellonella）作为替代宿主的研究。通过比较大蜡螟、柑橘木虱（Diaphorina citri）和蜜蜂（Apis mellifera）血淋巴的代谢谱，发现大蜡螟血淋巴富含氨基酸、有机酸、核苷酸和糖核苷酸，能支持Ca. L. asiaticus短期存活（达72小时），并引发明显的免疫黑化反应。该模型为高通量筛选抗菌化合物和研究宿主-病原互作提供了新平台，有望加速HLB防控策略的开发。

　　

柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB）是全球柑橘产业最具破坏性的病害之一，由一种难以体外培养的革兰氏阴性细菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”（Ca. L. asiaticus）引起，通过亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）传播。自2005年在美国佛罗里达州暴发以来，HLB导致柑橘产量严重下降，威胁产业可持续性。Ca. L. asiaticus感染柑橘全株，引起根系丧失、叶片黄化、果实早落，最终导致树木死亡。此外，感染还会引发代谢失衡、激素变化、淀粉积累，并抑制寄主植物的局部和系统先天免疫。然而，由于Ca. L. asiaticus无法在纯培养条件下生长，其生物学特性和致病机制研究受阻，也限制了有效防控策略的开发。

尽管 decades 的研究努力，Ca. L. asiaticus 仍无法在无菌条件下培养。早期尝试使用传统细菌培养基均告失败，这可能源于其高度简化的基因组缺失了多种氨基酸、维生素、辅因子及碳水化合物代谢的关键基因。以往研究尝试通过添加柑橘静脉提取物、果汁或与放线菌共培养来延长细菌存活，但仅能维持极短时间。近期开发的化学限定培养基或宿主游离微生物培养也未能实现可持续增殖或结果可重复性。因此，急需开发替代模型来支持Ca. L. asiaticus的生长和存活，便于在可控条件下进行研究。

大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫作为一种无脊椎动物模型，已被用于研究多种真菌、酵母和细菌病原体，其血淋巴营养丰富，含有ATP等关键能量源，且成本低、伦理限制少，能在25–37°C温度范围生存，与Ca. L. asiaticus的最适生长温度吻合。此外，大蜡螟幼虫体型较大，便于接种和操作。基于这些优势，本研究假设大蜡螟可能作为Ca. L. asiaticus的短期宿主，并通过比较其与柑橘木虱和蜜蜂血淋巴的代谢谱来验证这一假设。

为开展研究，作者团队采用了几项关键技术方法：首先，通过离心法从健康和黄龙病感染的柑橘（Valencia甜橙）中收集韧皮部汁液，并从柑橘木虱和大蜡螟中采集血淋巴样本；其次，利用非靶向代谢组学分析，使用三种衍生化试剂（TMS、MCF和BF3）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）全面解析血淋巴代谢物组成；第三，采用高效液相色谱（HPLC）分析核苷酸和糖核苷酸谱；第四，通过实时定量PCR（qPCR）监测接种后不同时间点Ca. L. asiaticus的滴度变化；最后，使用统计学方法（如方差分析、生存分析Kaplan-Meier曲线和错误发现率校正）确保结果可靠性。所有实验均设生物重复和技术重复，以保证可重复性。

G. mellonella幼虫对Ca. L. asiaticus入侵产生黑化反应

接种感染Ca. L. asiaticus的柑橘韧皮部汁液或柑橘木虱血淋巴后，大蜡螟幼虫在2–4天内出现明显黑化现象，形成黑色或棕色斑点，并随感染程度扩展。接种感染韧皮部汁液的幼虫黑化更快更严重，至3–4天时全身变黑褐色，表明严重感染导致死亡。

Ca. L. asiaticus在大蜡螟内的时序动态持久性

qPCR分析显示，接种感染韧皮部汁液或血淋巴的幼虫在0–48小时内保持较低Ct值（<32），表示高细菌载量，持久性可持续至48–72小时。72–96小时间Ct值显著升高，表明细菌滴度下降。分层聚类分析（HCA）和热图直观证实大蜡螟能支持Ca. L. asiaticus短期存活（达72小时），之后病原体水平降低。

Ca. L. asiaticus入侵降低大蜡螟幼虫寿命

生存分析表明，接种感染处理的幼虫生存概率显著降低，尤其是韧皮部汁液接种组。其寿命也显著缩短，而对照处理（PBS、未感染汁液或血淋巴）无显著差异。

TMS衍生化揭示D. citri、G. mellonella和A. mellifera血淋巴化学组成差异

非靶向代谢分析检测到82种代谢物，其中19种为三种昆虫共有。柑橘木虱血淋巴代谢物最多（68种，34种独有），大蜡螟40种，蜜蜂29种。大蜡螟血淋巴独有代谢物包括L-天冬氨酸、葡萄糖酸和三种未知化合物。值得注意的是，海藻糖在所有三种昆虫中均被检测到，但大蜡螟含量最高（17.87±0.69 mM），显著高于柑橘木虱（10.11±0.93 mM）和蜜蜂（0.77±0.42 mM）。柑橘木虱血淋巴以单糖（62.01%）和糖醇（27.09%）为主，有机酸（5.60%）、氨基酸（1.23%）和非蛋白氨基酸（NPAA, 0.58%）含量较低；而大蜡螟血淋巴氨基酸（40.06%）和有机酸（21.35%）占比最高，还有较高比例的二糖（17.42%）和NPAA（8.60%），显示其代谢灵活性更强。蜜蜂血淋巴单糖含量高（51.87%），有机酸（14.97%）和氨基酸（10.65%）适中。双向聚类分析显示三种昆虫代谢特征差异明显，柑橘木虱单独聚为一簇（50种代谢物较高或独有），大蜡螟聚为一簇（21种代谢物较高），蜜蜂聚为一簇（11种独有代谢物）。

大蜡螟血淋巴氨基酸和有机酸含量高于柑橘木虱

MCF衍生化分析检测到33种代谢物，其中25种为两种昆虫共有。大蜡螟血淋巴羧基化合物种类更丰富（31种 vs. 柑橘木虱27种），包括柠檬酸（7.05±2.06 mM，柑橘木虱未检出）和最高丰度氨基酸L-脯氨酸（32.50±4.42 mM vs. 11.26±1.75 mM）。大蜡螟在多数氨基酸和有机酸（如缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、组氨酸）上含量更高，而柑橘木虱富含脂肪酸和含硫化合物（如亚油酸、棕榈酸、半胱氨酸）。 fold-change分析显示，大蜡螟中柠檬酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸和组氨酸分别高出7.1、7.0、6.9、6.7和5.7倍，而柑橘木虱中半胱氨酸、亚油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸分别高出51.0、26.0、23.6、16.5、14.5和13.9倍。

BF3衍生化显示柑橘木虱血淋巴游离脂肪酸谱更显著

BF3衍生化检测到12种游离脂肪酸，大蜡螟略多样（10种，3种独有），柑橘木虱9种（2种独有）。柑橘木虱所有7种共有脂肪酸含量均显著更高，其中油酸（35.74±22.13 mM）最丰富，其次为硬脂酸（10.70±6.25 mM）和棕榈酸（5.73±3.25 mM）。经错误发现率校正后，仅油酸（C18:1(Z)）差异仍显著（q=0.0499）。

大蜡螟血淋巴核苷酸和糖核苷酸组成优于柑橘木虱

HPLC分析显示，大蜡螟血淋巴核苷酸和糖核苷酸种类更丰富（27种，6种独有），柑橘木虱24种（3种独有）。大蜡螟以三磷酸核苷（43%）为主，其次为二磷酸核苷（24%）和电子载体（21%），单磷酸核苷和未知核苷酸占比各6%。三磷酸核苷中ITP（25%）、UTP（15%）和ATP（3%）最丰富；二磷酸核苷包括ADP、CDP、GDP、IDP和UDP，以GDP为主；电子载体包括NADP、NAD和FAD。柑橘木虱缺乏CDP、FAD和四种未知化合物。尽管大蜡螟AMP、ADP和ATP含量更高，但AMP/ATP和ADP/ATP比率无显著差异，表明两者腺苷酸能量状态稳定。

fold-change分析显示，大蜡螟ITP、氧化型NADP和GDP分别高出170.0、66.4和63.5倍，而柑橘木虱GMP、GDP-Man和GDP-Fuc分别高出48.3、1.6和12.5倍。

结论与讨论

本研究通过综合代谢组学分析和感染实验，证明大蜡螟幼虫能作为Ca. L. asiaticus的短期宿主，支持其存活达72小时。大蜡螟血淋巴富含氨基酸、有机酸、核苷酸和糖核苷酸，提供Ca. L. asiaticus所需的营养和能量源，如ATP（其自身无法合成）、柠檬酸（作为主要碳源）和必需氨基酸（作为氮源）。此外，大蜡螟的微生物组可能通过提供其他生物因子增强细菌存活。这些发现为开发模拟大蜡螟血淋巴营养成分的合成或半限定培养基奠定了基础，有望推动Ca. L. asiaticus纯培养体系的建立。

然而，大蜡螟与天然载体柑橘木虱的生物学差异（如免疫系统激活导致黑化和抗菌肽表达）限制了病原体长期存活，细菌滴度在96小时下降。因此，该模型更适用于短期感染实验和抗菌化合物高通量筛选。未来研究可通过优化接种条件、免疫调节或膳食补充延长宿主存活时间。

该研究的创新点在于首次将大蜡螟用于植物病原体研究，填补了Liberibacter crescens替代模型与田间研究之间的关键空白。尽管存在局限性，大蜡螟模型为理解Ca. L. asiaticus的生物学特性、宿主-病原互作和筛选抗菌剂提供了实用、经济的平台，有望加速HLB可持续防控策略的开发。研究成果发表于《Communications Biology》，为管理媒介传播的植物病害提供了更广泛的策略启示。