转录组学和蛋白质组学研究揭示，TLPW针灸通过DPP4/SDF-1α/TGF-β/Smad信号通路抑制上皮-间充质转化，从而改善糖尿病肾病模型大鼠的蛋白尿症状

《Journal of Diabetes Research》：Transcriptomics and Proteomics Reveal That TLPW Acupuncture Ameliorates Proteinuria in Diabetic Kidney Disease Model Rats by Suppressing Epithelial-to-Mesenchymal Transition via the DPP4/SDF-1α/TGF-β/Smad Signalling Axis

糖尿病肾病（DKD）大鼠模型通过高脂饮食和链脲佐菌素诱导，实验组接受TLPW针灸干预，对照组和模型组分别作为对照。结果显示，TLPW针灸显著降低尿蛋白（24h-Upro）、血葡萄糖和血脂水平，减轻肾组织病理损伤（HE/PAS染色显示肾小球基底膜增厚、系膜基质增生改善），并抑制足细胞EMT（nephrin/podocin/CD2AP表达升高，desmin/Fsp1/α-SMA表达降低）。转录组学和蛋白质组学分析表明，TLPW针灸通过DPP4/SDF-1α/TGF-β/Smad信号轴调控，减少SDF-1α降解，抑制TGF-β1介导的Smad3磷酸化，从而抑制足细胞EMT和蛋白尿。AMD3100（SDF-1α受体拮抗剂）可逆转TLPW针灸的肾保护作用。

　　糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease, DKD）是一种由慢性高血糖引起的肾脏疾病，其特征是特定的病理结构和功能变化。作为糖尿病的主要微血管并发症之一，DKD是全球终末期肾病（End-Stage Renal Disease, ESRD）的主要病因之一。据国际糖尿病协会统计，2021年全球糖尿病患者约5.37亿，预计到2030年将增加至6.43亿。如果不进行干预，糖尿病会显著增加因ESRD导致的过早死亡风险，并与心血管死亡率的上升密切相关。因此，有效预防和治疗DKD具有重要的科学价值和社会意义。

DKD是一种复杂且异质的疾病，其核心组织病理学特征包括系膜细胞肥大、肾小球基质沉积以及足细胞丢失。其发病机制与肾血流动力学因素、代谢紊乱、氧化应激、炎症机制、遗传和表观遗传学、自噬等有关。足细胞的丢失和再分化以及上皮功能障碍被认为是导致DKD复发的重要因素。目前，现代医学治疗DKD主要集中在控制血糖、血压、改善脂代谢、抑制肾素-血管紧张素系统（RAS）以及使用ACEI/ARB类药物，如SGLT-2抑制剂。然而，DKD的进展仍然无法被有效控制。

传统中医（TCM）在改善DKD患者的临床症状和病理指标方面具有显著优势。作为中医治疗的一种代表，针灸被视为中华医学的瑰宝，同时也是西方国家认可的非药物治疗手段之一。近年来，基于针灸效应的机制研究显示，针灸可以通过改善DKD患者的临床症状和血液流变学，降低炎症反应，促进肾脏自噬，减少血糖和血脂水平，抑制足细胞活化等途径来缓解DKD的进展。然而，针灸的作用机制仍不完全清楚，涉及穴位选择和配伍、穴位局部动态机制、从局部到全身的多个环节和多种物质的相互作用。

基于长期临床实践和流行病学调查，全国著名中医工作室的传承人张志龙教授创建了“调脾利湿针灸”（TLPW针灸）这一治疗DKD的方法，其核心理念是通过调和脾肾、区分清浊来预防和治疗DKD。此前，我们通过多中心、随机对照和盲法试验，表明TLPW针灸的早期干预不仅可以缓解糖尿病肾病的临床表现，还能对脂代谢和血糖、eGFR和尿蛋白水平产生有利的调节作用。此外，我们先前的基础研究也表明，TLPW针灸的应用可以改善足细胞损伤，从而降低尿蛋白水平并延缓糖尿病肾病（DN）的进展。

本研究采用高脂饮食（HFD）结合STZ（链脲佐菌素）诱导的糖尿病肾病大鼠模型，探讨TLPW针灸对DKD大鼠的影响。实验组接受了4周的TLPW针灸治疗，通过RNA-Seq和TMT定量蛋白质组分析识别潜在的作用靶点，并通过分子生物学方法进行验证。我们推测，TLPW针灸可能通过抑制DPP4/SDF-1α/TGF-β/Smad信号轴的上皮-间质转化（EMT）来改善DKD大鼠的蛋白尿，并验证了这一假设。

在本研究中，总共使用了60只雄性SD大鼠。其中，10只被随机分配到阴性对照（NC）组，其余50只则维持在高脂饮食（HFD）中。经过18周的喂养后，HFD组的大鼠接受STZ腹腔注射以建立DKD模型。HFD组的大鼠（24小时尿蛋白排泄率≥30mg）被随机分为模型组（DKD）、调脾利湿针灸组（DKD+Acu）、AMD3100组（DKD+AMD3100）以及调脾利湿针灸联合AMD3100组（DKD+Acu+AMD3100）。干预持续4周，每周在治疗前记录各组的大鼠体重和随机血糖水平。干预结束后，收集尿液以评估尿蛋白-肌酐比值、24小时尿蛋白含量和尿液足细胞损伤相关酶水平。从对照组、DKD组和DKD+Acu组中随机选取3-5只大鼠的肾皮质组织进行转录组和蛋白质组分析，同时收集肾组织进行病理指标和机制的检测。

在DKD+Acu组中，24小时尿蛋白、尿蛋白Spondin 2（SPON2）、尿蛋白-肌酐比值（UACR）以及随机血清肌酐、尿素氮和血糖水平均显著低于DKD组。根据转录组和蛋白质组的结果，我们使用免疫荧光或Western blotting方法检测足细胞特异性标志物（如nephrin、podocin和CD2AP）以及上皮-间质转化（EMT）标志物（如desmin、Fsp1和α-SMA）和DPP-4/SDF-1α/TGF-β/Smad信号轴的成分；在DKD+Acu组中，nephrin、podocin和CD2AP的表达显著升高，而desmin、Fsp1和α-SMA的表达显著降低。TLPW针灸调节了Dpp-4/SDF-1α/TGF-β/Smad信号轴，但这一效果被AMD3100减弱。因此，TLPW针灸通过调节DPP-4/SDF-1α/TGF-β/Smad信号轴，抑制足细胞EMT，减轻足细胞和肾脏损伤，从而改善DKD模型大鼠的蛋白尿。

为了进一步探讨TLPW针灸对DKD大鼠的影响，我们采用高脂饮食（HFD）结合STZ诱导的DKD模型。HFD组大鼠在18周喂养后接受STZ腹腔注射以建立DKD模型。1周后，通过检测空腹尾血血糖浓度是否持续超过16.7 mmol/L来确认糖尿病。4周后，24小时尿蛋白含量超过30 mg被定义为DKD。最终，36只大鼠成功建立了DKD模型，并被随机分配到四个组（每组9只）。在DKD建模过程中，我们观察到DKD组大鼠的24小时尿蛋白浓度、血糖水平和体重均显著改变。在第23周，我们检测到DKD组大鼠体重增加的速率有所减缓（图1b）。此外，DKD组大鼠的血糖水平显著高于对照组（图1c）。同时，DKD大鼠的尿蛋白浓度显著升高，并在24小时内超过30 mg（图1d）。

为了进一步评估DKD大鼠的肾脏损伤程度，我们对肾组织进行了HE、PAS染色和透射电镜（TEM）分析（图3）。DKD组和DKD+Acu组表现出肾小球毛细血管肥大、系膜基质增生和基底膜增厚，而对照组未见这些特征。这表明DKD导致不同程度的肾脏损伤。然而，在DKD+Acu组中，我们观察到更明显的病理改善（图3a,b）。此外，我们发现DKD导致足细胞损伤，表现为基底膜增厚，足细胞足突（FPs）表现出病理改变，包括局部融合和严重消失，导致结构完整性丧失。然而，在DKD+Acu组中，足突的融合率降低，数量增加，基底膜变薄（图3c）。

为了进一步探讨TLPW针灸对DKD大鼠的影响，我们进行了转录组和TMT定量蛋白质组分析。结果显示，DKD组与对照组之间有3275个差异表达基因（DEGs），其中1630个基因上调，1645个基因下调。此外，DKD+Acu组与DKD组之间有1012个DEGs，包括473个上调基因和539个下调基因。结果如图4a、4b和4c所示。为了进一步明确TLPW针灸在减少DKD大鼠蛋白尿中的主要靶点，我们对DKD组和对照组之间的DEGs，以及DKD+Acu组和DKD组之间的DEGs进行了KEGG或GSEA分析。结果如图4d、4e和4f所示。设定显著性阈值为调整后的p值<0.05和q值<0.2，KEGG分析显示，DKD组的紧密连接、粘附连接、胶质细胞信号通路和间隙连接显著下调，而其他糖降解和蛋白酶体通路显著上调。此外，我们进行了DKD组和DKD+Acu组的GSEA分析，发现DKD+Acu组与胰岛素分泌（RNO04911）、胰高血糖素信号（RNO04922）和粘附连接（RNO04520）通路高度正相关。因此，我们推测TLPW针灸可能通过调节糖脂代谢和粘附连接，抑制DKD大鼠足细胞的EMT，从而减少蛋白尿和足细胞损伤。

TMT定量蛋白质组分析显示，在4周干预后，DKD+Acu组和DKD组的大鼠肾皮质组织中，共有5099个蛋白质被鉴定，其中4351个具有定量信息。使用t检验和p值<0.05作为显著变化的判断标准，DKD+Acu组和DKD组中，125个蛋白质下调，130个蛋白质上调（图5a）。对差异表达蛋白质进行的KEGG通路注释显示，上调的蛋白质主要涉及糖脂代谢通路；下调的蛋白质则主要分布在抗原识别和表达以及蛋白质消化和吸收相关通路（图5b,c）。上调的差异表达蛋白质主要分布在核糖体通路、代谢通路、脂肪酸代谢、过氧化物酶体和PPAR信号通路。下调的差异表达蛋白质则主要分布在蛋白质消化、代谢通路、吸收通路和抗体反应和表达通路。通过应用STRING-db.org在线工具构建的PPI网络结果显示，DPP4（图5e,f）在调节网络中具有较高的MCODE得分，表明其在调节网络中的重要性。因此，TLPW针灸在4周干预后可以改善DKD大鼠的糖脂代谢和免疫相关蛋白表达，而DPP4蛋白在其中发挥了重要作用。结合转录组分析（2.3.5转录组分析），这些结果表明，DPP-4可以酶解多种肽靶标，如脑钠尿肽（BNP）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、SDF-1α和神经肽Y，而SDF-1α可以抑制TGF-β的表达。我们推测，TLPW针灸通过抑制DPP-4的活性，减少SDF-1α的降解，从而抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活，改善足细胞EMT并减少蛋白尿。

为了进一步探讨DPP4/SDF-1α/TGF-β1/Smad信号轴在TLPW针灸机制中的作用，我们使用了SDF-1α受体拮抗剂AMD3100进行相关实验。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了各组大鼠肾皮质和血清中Dpp-4的浓度（图8a,b）。4周的TLPW针灸干预后，DKD、DKD+AMD3100、DKD+Acu和DKD+Acu+AMD3100组的肾皮质和血清中Dpp-4浓度显著高于对照组（*p < 0.05或**p < 0.01）。DKD+Acu组的Dpp-4含量显著低于DKD组（#p < 0.05）。AMD3100抑制了TLPW针灸的肾脏保护作用，并在DKD+Acu+AMD3100组中显著提高了Dpp-4的含量，与DKD+Acu组相比差异显著（@@p < 0.01）。Western blot检测了各组大鼠肾皮质中DPP4/SDF-1α/TGF-β1/Smad信号通路蛋白水平（图8b,f）。4周的TLPW针灸干预后，DKD、DKD+AMD3100、DKD+Acu和DKD+Acu+AMD3100组的DPP4和TGF-β1蛋白相对表达量以及p-Smad3/Smad3指数均显著高于对照组（**p < 0.01）。然而，在DKD+Acu组中，这些蛋白的相对表达量无显著变化（p > 0.05）。DKD+Acu组的DPP4和TGF-β1蛋白以及p-Smad3/Smad3指数均显著低于DKD组（##p < 0.01），表明TLPW针灸可以抑制DKD大鼠中DPP4和TGF-β1的表达，从而减少TGF-β1/Smad3信号通路的激活。在AMD3100干预后，我们发现DKD+Acu+AMD3100组的p-Smad3和TGF-β1水平显著高于DKD+Acu组，表明AMD3100减弱了TLPW针灸对TGF-β1/Smad3信号通路的抑制作用。

综上所述，本研究发现TLPW针灸可以通过抑制DPP4/SDF-1α/TGF-β1/Smad信号轴的上皮-间质转化（EMT）来改善DKD大鼠的蛋白尿，这一作用得到了进一步的动物实验验证。研究结果表明，TLPW针灸可以改善DKD大鼠的血糖和脂代谢紊乱，保护肾脏结构并减少肾脏损伤。此外，TLPW针灸通过上调足细胞特异性标志物（如nephrin和podocin）和抑制间质细胞标志物（如desmin、α-SMA和Fsp1）的表达，从而改善DKD大鼠的足细胞EMT。通过使用SDF-1α受体CXCR4拮抗剂AMD3100进行相关机制研究，我们发现TLPW针灸可以通过抑制DPP4的活性，减少SDF-1α的降解，从而抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活，改善足细胞EMT并减少蛋白尿。因此，TLPW针灸可以通过调节DPP4/SDF-1α/TGF-β信号轴，减轻足细胞损伤并减少蛋白尿，从而降低肾脏损伤。