Notch1突变：增强口腔鳞状细胞癌免疫识别的潜在治疗靶点

本研究深入探讨Notch1突变在口腔鳞癌(OSCC)免疫微环境重塑中的关键作用，发现其通过调控PD-L1表达与CD8+ T细胞浸润增强抗肿瘤免疫应答，为免疫检查点抑制剂(ICI)治疗提供新策略。

　　

ABSTRACT

背景

Notch1作为肿瘤抑制基因，是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中最常发生突变的基因之一。本研究旨在探讨Notch1突变对口腔鳞状细胞癌(OSCC)抗肿瘤免疫的影响及其临床意义。

研究目的

探究Notch1突变与免疫相关蛋白表达的关系，并利用公共数据库分析Notch1突变对免疫微环境的影响。

方法与结果

通过qPCR检测OSCC细胞系中Notch1-4的表达特征。采用CCK8和伤口愈合实验分析Notch1敲低后的细胞增殖和迁移能力。使用蛋白质印迹和流式细胞术评估程序性死亡配体1(PD-L1)的定位和表达。对47例OSCC患者的体细胞突变分析显示，Notch1突变与肿瘤浸润CD8⁺ T细胞和PD-L1表达存在相关性。TCGA数据库分析表明，Notch1突变肿瘤比野生型肿瘤具有更高水平的幼稚CD8⁺ T细胞。

结论

Notch1突变可能成为增强OSCC免疫识别的潜在治疗靶点。

1 Introduction

口腔癌是头颈部主要恶性肿瘤，当前治疗手段包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，但五年生存率仍低于50%。免疫治疗虽为复发或转移性OSCC带来希望，但应答率仅14%-18%。Notch家族包含四个跨膜受体(Notch1-4)，Notch1在调节细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用。测序研究发现Notch1是OSCC中高频突变基因，但其在肿瘤发生中的作用存在争议。研究表明Notch信号通路抑制可下调PD-1表达，γ-分泌酶抑制剂DAPT能减少免疫抑制细胞浸润并增加细胞毒性T细胞。PD-L1与T细胞PD-1相互作用帮助肿瘤细胞逃避免疫监视，而Notch信号与PD-L1表达的关系在肝癌中已有报道。前期研究发现Notch通路突变与CD8⁺ T细胞浸润和PD-L1表达存在潜在关联，可能通过增加肿瘤突变负荷(TMB)增强免疫治疗应答。

2 Methods

2.1 细胞系与组织样本

采用唇成纤维细胞系(KD)和15种OSCC细胞系，所有细胞系经过STR认证和无支原体确认。47例OSCC患者肿瘤组织样本经伦理委员会批准获得。

2.2 RNA提取与qPCR分析

使用RNeasy Mini Kit提取总RNA，采用TaqMan阵列分析Notch1-4表达，以GAPDH作为内参。

2.3 细胞增殖实验

CCK-8法检测DAPT处理和Notch1 siRNA敲低后的细胞增殖变化。

2.4 伤口愈合实验

观察DAPT处理对细胞迁移能力的影响。

2.5 全外显子测序

使用Illumina NovaSeq 6000进行测序，ANNOVAR进行变异注释。

2.6 DAPT处理与Notch1 siRNA转染

优化DAPT浓度至10μM，采用Lipofectamine RNAiMAX进行siRNA转染。

2.7 蛋白质印迹分析

使用RIPA缓冲液提取蛋白，检测Notch1、cleaved Notch1、Hes1和PD-L1表达。

2.8 流式细胞术

分析细胞表面PD-L1表达水平。

2.9 免疫组化评估

评估PD-L1 CPS评分和CD8⁺ T细胞浸润密度。

2.10 生物信息学分析

利用TIMER 2.0分析TCGA数据库中Notch1突变与免疫浸润的关系。

2.11 统计分析

采用χ2检验和t检验进行组间比较，p<0.05为显著。

3 Results

3.1 OSCC细胞系中Notch1蛋白分析

qPCR显示不同细胞系Notch1表达差异显著，Western blot证实HSC-3细胞Notch1表达低于KD细胞，而HO-1-u-1、SAS和OSC-20细胞表达较高。

3.2 Notch1敲低抑制细胞增殖但不影响迁移

DAPT处理对OSC-20细胞生长无显著抑制，但对HSC-3、HO-1-u-1和SAS细胞有抑制作用。Notch1 siRNA显著抑制所有细胞系生长。伤口愈合实验显示DAPT处理对细胞迁移无显著影响。

3.3 Notch1功能结构域突变分布

外显子测序发现两个错义突变(G672V和E415K)位于EGF样结构域，在脊椎动物Notch1直系同源物中高度保守。HSC-3细胞在exon 31存在剪接位点突变。

3.4 Notch抑制剂或敲低对PD-L1蛋白的影响

DAPT处理不影响OSC-20和HSC-3细胞的PD-L1表达，但降低HO-1-u-1细胞的PD-L1和Hes1表达。Notch1 siRNA在HO-1-u-1细胞中同样抑制PD-L1和Hes1表达。

3.5 流式细胞术分析PD-L1表达

Notch1敲低后，OSC-20细胞PD-L1阳性率无变化，HSC-3细胞显著增加，HO-1-u-1细胞轻微增加，SAS细胞几乎无变化。DAPT处理对PD-L1表达影响较小。

3.6 Notch1突变临床参数分析

12例PD-L1 CPS>1%患者中，7例存在Notch1突变。5例突变患者中71.4%显示CD8⁺ T细胞>200/视野，而非突变组仅40%患者达到此水平。

3.7 Notch1突变与炎症微环境相关

TIMER2.0分析显示Notch1突变型HNSCC中CD8⁺ T细胞(TIMER算法，p=0.039)和CD8⁺ 幼稚T细胞(XCELL算法，p=0.015)浸润水平显著高于野生型。

4 Discussion

Notch1突变在多种癌症中发挥重要作用，是HNSCC中第二高频突变基因。本研究证实Notch1突变在OSCC中可能具有肿瘤抑制功能。近期研究发现Notch1突变与NSCLC中较高TMB相关，而SCLC中Notch1突变状态与PD-L1表达呈负相关。本研究首次揭示Notch1突变通过调节PD-L1表达和CD8⁺ T细胞浸润影响OSCC免疫微环境。生物信息学分析证实Notch1突变型肿瘤具有更高水平的CD8⁺ T细胞浸润。最新研究表明Notch信号通过FOXM1影响PD-L1水平，Notch抑制可增强CD8⁺ T细胞细胞毒性。本研究为Notch1突变作为免疫治疗应答预测标志物提供了理论依据，但由于样本量限制，需进一步通过共培养实验验证免疫学后果，并在更大队列中进行临床验证。

研究结果表明，Notch1突变可能成为增强口腔鳞状细胞癌免疫识别的潜在治疗靶点，为改善免疫治疗效果提供了新的方向。