鳞翅目昆虫性别决定新机制：pyralid蛾类W染色体来源的雌性piRNA的趋同进化

本研究针对鳞翅目昆虫性别决定信号多样且进化路径不明确的问题，通过对地中海粉螟（Ephestia kuehniella）和印度谷螟（Plodia interpunctella）开展系统研究，发现其W染色体上特异的EkMom/PiMom piRNA通过降解Z连锁的Masc mRNA触发雌性发育。研究首次在pyralid蛾类中证实了非编码RNA作为初级性别决定信号的功能，揭示了鳞翅目昆虫性别决定机制的趋同进化特征，为昆虫性别决定系统的进化研究提供了重要范式。

　　

在昆虫世界中，性别决定机制展现出惊人的多样性，尤其鳞翅目昆虫（蛾类和蝶类）的性别决定系统一直困扰着科学家。与人类XX/XY系统不同，鳞翅目采用独特的WZ/ZZ系统（雌性为WZ，雄性为ZZ），其中W染色体扮演着决定性角色。然而，这个关键染色体却充满了谜团——它主要由重复序列和转座元件组成，几乎不包含蛋白质编码基因。长期以来，科学家们困惑于：W染色体究竟如何控制雌性发育？

在经典模式生物家蚕（Bombyx mori）中，这个谜题部分得以解开。研究发现其W染色体上的Fem piRNA能够靶向降解Z染色体上的Masculinizer（Masc）基因的mRNA，从而触发雌性发育通路。但这种机制是否在其它鳞翅目昆虫中保守存在，却一直是个未解之谜。前期研究表明，与家蚕亲缘关系较近的T. varians和较远的O. furnacalis都不存在类似的Fem piRNA机制，暗示鳞翅目昆虫可能独立进化出了多种多样的性别决定策略。

为了探索这一进化谜题，来自荷兰和捷克的研究团队将目光投向了pyralid蛾类。他们选择地中海粉螟（Ephestia kuehniella）作为主要研究对象，这种昆虫是早期遗传学研究的模式生物，也是性染色体研究的重要模型。研究团队运用了多种前沿技术方法：通过生物信息学方法筛选W染色体序列中可能编码 feminizing small RNA的区域；采用荧光原位杂交（FISH）技术精确定位基因在染色体上的分布；利用Southern blotting分析基因簇的结构特征；通过small RNA测序技术检测piRNA的表达时序；运用改良的5' RACE技术验证mRNA的切割位点；并采用RNA干扰（RNAi）技术进行功能验证实验。样本来自实验室培养的E. kuehniella WT-C02品系和从捷克?eské Budějovice采集的P. interpunctella野外种群。

Identification of putative feminizing small RNAs in Ephestia kuehniella

研究人员首先对E. kuehniella的W染色体序列进行生物信息学筛查，发现多个与EkMasc和EkMascB基因高度同源的区域。特别值得注意的是，在exon IX区域存在一个25核苷酸的片段呈现出明显的过表达特征，该区域被命名为EkMom（E. kuehniella Moth-overruler-of-masculinization）。测序分析显示，94%的reads能够组装成一个一致的EkMom序列，该序列与雄性基因组无同源性，仅其中的短RNA序列（EkMom piRNA）与EkMasc和EkMascB基因的部分序列同源。

Structure of EkMom and EkMascW on the W chromosome of Ephestia kuehniella

PCR扩增显示EkMom呈现多条带型，表明其串联重复结构。测序证实EkMom单体大小为602bp，不同拷贝间序列一致性达98.2%。通过荧光原位杂交（FISH）技术在W染色体上定位到一个大的EkMom基因簇和一个EkMascW基因簇。Southern杂交显示EkMom在雌性基因组中形成规律的梯状条带，而在雄性中完全缺失，证实其W染色体特异性。

Expression of sex-determining genes and timing of sexual fate in Ephestia kuehniella

时序表达分析发现，EkMom在WZ个体整个早期胚胎发育过程中持续表达，而在ZZ个体中仅在12-16 hpo（产卵后小时）检测到，18 hpo后完全消失。雄性特异性剪接变体EkImpM在14 hpo开始表达，恰好在Ekdsx从雌性向雄性特异性剪接转换之前。

Expression of EkMom and EkMascW piRNAs in Ephestia kuehniella

Small RNA测序显示，在7-9 hpo时期未能检测到EkMom piRNA，但在11-13 hpo时期成功检测到其表达。同时发现多个来源于EkMascW的小RNA可能靶向EkMasc和/或EkMascB mRNA。这些small RNA序列表现出典型的piRNA特征：反义序列具有明显的1U偏好性，正义序列有10A偏好性。

Identification of PiMom piRNA in Plodia interpunctella

在近缘种P. interpunctella中，研究人员同样发现了一个26-27核苷酸长的PiMom piRNA，其与PiMasc仅两个核苷酸差异。该piRNA在卵期small RNA转录组中高表达，拷贝数约为EkMom的10倍。

Structure of PiMom on the W chromosome of Plodia interpunctella

PiMom同样呈现女性特异性和串联重复结构，单体大小434-442bp，序列一致性95-98%。FISH定位显示PiMom与W特异性标记PiSAT1位于W染色体上相邻位置。

Comparison of feminizing piRNAs

序列比对发现EkMom和PiMom piRNA具有高度序列一致性，滑动窗口分析显示在piRNA区域存在至少10个核苷酸的连续一致性区域。但与家蚕的Fem piRNA比较显示完全没有同源性，表明独立起源。

Maternal provision of EkMom and PiMom

母源提供实验显示，在E. kuehniella中，EkMom和EkMasc/EkMascB RNA都被母源提供给卵子；而在P. interpunctella中，仅PiMasc RNA被母源提供，PiMom RNA则不是。

Functional analysis of EkMom piRNA and PiMom piRNA

功能实验证实了Mom piRNA的 feminizing 功能。改良的5' RACE实验显示，在雌性胚胎中，EkMasc和EkMascB mRNA在预测的EkMom piRNA切割位点被准确切割；同样，PiMasc mRNA也在预测的PiMom piRNA切割位点被切割。RNAi实验表明，注射EkMom-dsRNA能导致雌性胚胎中的Ekdsx剪接从雌性型转向雄性型，证明EkMom是雌性发育所必需的。

本研究得出了几个重要结论：首先，在两种pyralid蛾类中，W染色体上的Mom piRNA是触发雌性发育的初级性别决定信号，通过降解Masc mRNA来实现其功能；其次，Mom piRNA虽然在家蚕和pyralid蛾类中功能相似，但序列完全不同，表明它们是独立进化而来的；第三，E. kuehniella中的EkMascW可能代表了 feminizing piRNA的进化前体，说明W染色体上Masc基因的易位可能是新 feminizing piRNA产生的一种途径。

这项研究的重大意义在于揭示了鳞翅目昆虫性别决定机制的趋同进化现象。尽管家蚕和pyralid蛾类在进化树上相距甚远，但它们都利用了相似的piRNA机制来解决性别决定问题。这种"殊途同归"的进化策略为我们理解生物系统中复杂性状的进化提供了精彩案例。同时，研究也展示了非编码RNA在重要发育过程中的核心作用，拓宽了我们对遗传调控机制的认识。这些发现不仅对基础生物学有重要贡献，也为农业害虫防治提供了新的思路——通过干扰性别决定通路来控制害虫种群数量。

论文发表在《BMC Biology》期刊，为鳞翅目昆虫性别决定机制的研究树立了新的里程碑，为未来研究其他昆虫类群的性别决定系统进化提供了重要参考框架。