冷冻电镜揭示CasRx与DjCas13d的RNA靶向机制：结构导向的Cas13d酶理性设计

本研究通过冷冻电镜解析了CasRx和DjCas13d在二元（蛋白-crRNA）及三元（蛋白-crRNA-靶RNA）状态下的高分辨率结构，并首次报道了DjCas13d的apo结构。研究系统比较了二者在顺式（cis）与反式（trans）切割活性上的差异，发现DjCas13d具有更低的反式切割活性。基于结构分析，研究团队对CasRx进行理性改造，获得多个突变体（如Rx-△1、Rx-△12和Rx-P2），在保留顺式切割效率的同时显著降低反式活性。该研究为理解Cas13d家族酶的激活机制和开发高精度RNA靶向工具提供了重要结构基础。

　　

在基因编辑技术飞速发展的今天，CRISPR系统已经从DNA水平拓展至RNA水平的精准调控。尤其是CRISPR-Cas13系统，因其能够特异性地靶向和切割RNA，在基础研究、疾病治疗和分子诊断中展现出巨大潜力。Cas13d亚家族中的CasRx（也称为RfxCas13d）自发现以来，因其高特异性、高效性以及较低的反式（trans）切割活性，已成为RNA干扰和编辑的重要工具。然而，其残留的反式活性仍是在体应用中的潜在隐患。最近，研究人员从宏基因组数据中鉴定出DjCas13d，初步研究表明其反式切割活性比CasRx更低，同时保持相当的顺式（cis）切割效率，且分子更小，因此被视为更具应用前景的替代工具。

尽管已有研究对EsCas13d和UrCas13d等活性较弱的同源酶进行了结构解析，但对于功能更优、应用更广泛的CasRx和DjCas13d，其识别底物RNA和激活催化机制的结构基础仍不明确。正是为了解决这一关键问题，Xiaoyan Chen、Yongru He等研究人员在《Nucleic Acids Research》上发表了最新研究成果，通过综合运用结构生物学与生物化学手段，首次揭示了CasRx与DjCas13d在不同状态下的精细结构，并基于结构信息对CasRx进行了理性改造，为开发下一代高保真RNA编辑工具奠定基础。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了DjCas13d和CasRx的二元和三元复合物结构，以及DjCas13d的apo结构；通过体外生化实验系统评估了野生型及突变型蛋白的顺式和反式RNA切割活性；并借助结构比对和理性设计，构建并验证了多个CasRx突变体。

研究结果主要包括以下几个方面：

Biochemical characterization of DjCas13d and CasRx

通过体外切割实验发现，在顺式切割中，DjCas13d与CasRx活性相当；而在反式切割中，当靶RNA（TR）浓度低于200 nM时，DjCas13d的反式活性显著低于CasRx。但在高浓度TR（>200 nM）下，DjCas13d的反式活性反而超过CasRx，表明其活性具有浓度依赖性。

Structural analyses of DjCas13d enzyme

研究人员成功解析了DjCas13d与crRNA的二元复合物结构（分辨率3.05 ?）及与TR1的三元复合物结构（分辨率3.27 ?）。结构显示，crRNA的重复区（repeat）形成茎环结构后呈U形转弯，而间隔区（spacer）则在结合靶RNA后形成19 bp的RNA双链。与二元状态相比，三元复合物中NTD结构域变得无序，Helical-1发生向后移动，催化残基相互靠近，提示这些变化与酶激活相关。

Structural dynamics of DjCas13d enzyme

进一步通过解析DjCas13d与更长TR2的三元复合物（分辨率3.46 ?），发现其可存在多种构象状态，包括一种催化中心被破坏的“失活状态”。此外，还首次解析了apo-DjCas13d的结构（分辨率3.47 ?），发现其与二元、三元状态下的NUC lobe结构相似，但REC lobe构象差异显著。这些结果提示DjCas13d在溶液中存在构象动态平衡，可能与其较低的反式切割活性有关。

Structural analyses of CasRx enzyme

CasRx的二元复合物（分辨率2.86 ?）和三元复合物（分辨率3.46 ?）结构也被成功解析。与DjCas13d相比，CasRx的三元复合物中NTD仍具有有序结构，并与crRNA重复区及spacer-TR连接处相互作用。其spacer-TR3双链与重复茎环轴之间存在约44°的较大交叉角，与DjCas13d中观察到的17°形成鲜明对比。

Comparative structural analysis of DjCas13d and CasRx

对比显示，两者的二元复合物结构高度相似，但三元复合物中REC lobe和核酸组分的构象存在显著差异。DjCas13d的NTD无序化，CasRx的NTD则参与底物识别；此外，两者在催化中心周围的环区结构、带电荷斑块等方面也存在明显不同。这些结构差异可能是二者反式切割活性不同的分子基础。

Biochemical characterization of CasRx mutants

基于上述结构信息，研究团队设计了多个CasRx缺失突变体（如Rx-△1、Rx-△12）和点突变体（如Rx-P2）。生化实验表明，部分突变体（如Rx-△1、Rx-△12和Rx-P2）在显著降低反式活性的同时，仍保留50%以上的顺式切割效率，其表现与已报道的高精度变体hpCas13d相当。

综上所述，本研究通过高分辨率结构解析与功能验证，揭示了CasRx和DjCas13d在分子机制上的关键差异，特别是DjCas13d因其构象动态特性而具有更低的反式切割活性。研究不仅深化了对Cas13d酶家族激活机制的理解，还通过结构导向的蛋白质工程获得了多个具有优化切割特性的CasRx变体，为发展更安全、更精准的RNA靶向工具提供了重要的理论依据和材料基础。