WRKY7转录因子正向调控烟草NRG1免疫受体表达的新机制及其在植物抗病中的关键作用

本刊推荐：为解析植物免疫系统中helper NLR（NRG1）的转录调控机制，Wu等研究人员开展了WRKY转录因子调控NRG1表达的主题研究。通过DNA pulldown、酵母单杂交及双荧光素酶报告系统等技术，发现WRKY7直接结合NRG1启动子W-box motif并正向调控其表达。该调控模块同时参与基础免疫和效应子触发免疫（ETI），且WRKY7与NRG1形成正反馈环路。该研究为作物抗病基因工程提供了重要理论依据。

　　

在植物与病原体亿万年的共进化过程中，植物演化出了精密的先天免疫系统。这一系统可分为两个层面：由细胞表面受体介导的基础免疫，以及由胞内核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）受体蛋白介导的效应子触发免疫（Effector-Triggered Immunity, ETI）。当病原体分泌效应子（effector）到植物细胞内部时，特定的NLR蛋白能够识别这些效应子并激活强烈的免疫反应，通常伴随着局部细胞死亡（超敏反应，hypersensitive response），从而限制病原体扩散。

然而，并非所有NLR都能独立完成免疫应答。一类特殊的"辅助型NLR"（helper NLR）蛋白，如NRG1（N Requirement Gene 1），成为TIR结构域NLR（TNL）类受体激活免疫的关键伙伴。近年来，通过结构生物学和生物化学研究，科学家已经揭示了效应子识别后NRG1激活和寡聚化的分子细节。但一个关键问题仍未解决：NRG1的表达本身是如何被调控的？

WRKY转录因子家族因其DNA结合域包含保守的WRKYGQK基序而得名，能够特异性结合靶基因启动子中的W-box顺式元件，在植物发育和非生物/生物胁迫响应中发挥核心调控作用。尽管已知多个WRKY成员参与防御基因的表达调控，但它们是否以及如何调控helper NLR的表达仍不清楚。

近期发表在《Plant Physiology》的研究中，Wu等研究人员发现WRKY7转录因子直接正向调控NRG1的表达，并揭示了该调控模块在植物免疫中的关键作用。

研究人员通过DNA pulldown技术筛选与NRG1启动子结合的蛋白，并利用本氏烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时过表达技术筛选出7个能限制芜菁花叶病毒（TuMV）扩散的候选蛋白。鉴于NRG1启动子中存在W-box motif，他们选择WRKY7进行深入解析。通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）和酵母单杂交实验证实了WRKY7与NRG1启动子的直接结合。双荧光素酶报告系统显示WRKY7过表达显著增强由NRG1启动子驱动的荧光素酶活性，而W-box突变则消除了这一效应。

在功能层面，WRKY7沉默导致NRG1转录水平下降，并增强植物对GFP标记的烟草花叶病毒（TMV）的敏感性。在效应子触发免疫模型中，WRKY7沉默显著减弱了由TNL受体N（识别TMV复制酶p50）和Roq1（识别黄单胞菌Xe分泌的XopQ效应子）介导的细胞死亡和抗病性。尤为重要的是，研究人员发现WRKY7与NRG1之间存在正反馈环路：NRG1缺失突变体中WRKY7的诱导表达受损，而WRKY7又直接促进NRG1转录。这种双向放大机制可能解释ETI中细胞死亡的快速启动特性。

主要技术方法

本研究以本氏烟草为模型，通过DNA pulldown筛选NRG1启动子结合蛋白；利用瞬时过表达和病毒诱导基因沉默（VIGS）技术进行功能验证；采用EMSA和酵母单杂交验证WRKY7与DNA的直接结合；通过双荧光素酶报告系统分析启动子活性；使用qRT-PCR量化基因表达；通过病原接种实验（包括TMV、TuMV和Xanthomonas euvesicatoria）表型分析。

WRKY7直接结合NRG1启动子并激活其转录

通过体外和体内实验证明WRKY7特异性结合NRG1启动子中的W-box motif，并正向调控其转录活性。

WRKY7正调控基础免疫反应

WRKY7沉默导致NRG1表达下调和对TMV易感性增加，表明WRKY7通过调控NRG1参与基础免疫。

WRKY7是效应子触发免疫的正调控因子

在由TNL受体N和Roq1介导的ETI中，WRKY7沉默减弱细胞死亡和抗病性，证明其在ETI中不可或缺。

WRKY7与NRG1形成正反馈调控环路

NRG1缺失抑制病原诱导的WRKY7表达，而WRKY7直接激活NRG1转录，构成放大免疫信号的正反馈回路。

该研究首次揭示了WRKY转录因子对helper NLR NRG1的直接转录调控机制，阐明了WRKY7-NRG1模块在协调植物两层免疫系统中的枢纽作用。正反馈回路的发现为理解ETI中细胞死亡的快速启动提供了新视角。在应用层面，对NLR表达调控网络的深入理解有助于克服抗病基因工程中过度表达引发的自发细胞死亡和生长抑制等问题，为设计合成NLR受体和作物抗病育种提供理论支持。