从盗取细胞器到永久质体：基于比较转录组学的甲藻-硅藻内共生演化机制研究

本研究通过比较转录组学分析，揭示了“双甲藻”（dinotoms）中硅藻来源的第三级质体从临时盗取（kleptoplastidy）到永久整合的演化连续谱。研究发现内共生硅藻核保持转录自主性，但表达谱向光合作用相关基因倾斜；永久整合态物种（Durinskia kwazulunatalensis）更表现出基因组GC含量升高、内含子插入等“类核形体化”（nucleomorphising）改造，并进化出己糖磷酸（hexose phosphate）输出通路。研究为理解内共生过程中细胞周期同步调控和代谢整合提供了分子证据。

　　

在生命演化史上，质体的起源是一次革命性事件。它们源于古代真核宿主与光合作用猎物之间的内共生事件，但从临时联盟到永久细胞器的转变过程始终是 evolutionary black box（演化黑箱）。近年来，一类称为“双甲藻”（dinotoms）的稀有甲藻模型为研究者提供了窥探这一过程的独特窗口。这类生物保留了硅藻来源的第三级质体，并展现出从临时盗取细胞器到永久保留猎物细胞器的不同整合程度，成为研究细胞器生成（organellogenesis）的活体实验室。

本研究聚焦于两种处于不同质体整合水平的双甲藻：处于细胞器盗取（kleptoplastidy）状态的 Durinskia capensis 及其硅藻猎物 Nitzschia captiva，以及处于早期永久整合状态的近缘种 Durinskia kwazulunatalensis。通过比较转录组学分析，研究团队深入探索了质体整合的分子基础，试图回答五个关键问题：内共生基因转移（EGT）是否发生？硅藻转录活动是否受甲藻宿主控制？靶向质体和线粒体的硅藻基因是否活跃转录？光合产物碳水化合物如何从硅藻区室运输到甲藻细胞质？以及硅藻核分裂如何与宿主细胞周期同步调控？

转录本分离与起源鉴定

由于无法从双甲藻细胞中分离出单个硅藻，研究对总细胞RNA进行测序，获得了同时包含宿主甲藻和其内共生硅藻（本研究称为ODPs, organelle-retaining diatom-derived plastids）的转录组数据。通过k-mer分析成功将转录本按起源分为硅藻源和甲藻源两大簇。值得注意的是，在 D. kwazulunatalensis 中，4.05%的硅藻源转录本表现出与甲藻基因相似的k-mer特征，暗示这些基因可能正在发生核苷酸组成上的“驯化”。

内共生基因转移（EGT）的可能性

在短暂维持的细胞器盗取关系中，EGT通常不是关键过程。与具有永久整合核形体（nucleomorph）的隐藻（cryptophytes）不同，双甲藻中EGT事件极为稀少。研究利用甲藻特异的剪接前导序列（SL序列）和GC含量作为判别标准，发现 D. kwazulunatalensis 的ODPs平均GC含量高达50.82%，显著高于自由生活硅藻（通常低于43-58%）。其中23个高GC含量的硅藻基因在密码子使用上仍偏向硅藻模式，表明它们可能仍位于硅藻基因组中，但正经历着适应细胞内环境的早期改造。

基因组修饰的可能性

更引人注目的证据来自核糖体DNA的结构变异。在三个独立的 D. kwazulunatalensis 菌株中，其18S rDNA均含有四个独特的插入序列（86-95 bp），这些插入在自由生活硅藻或其他双甲藻中均不存在。其中一个插入含有剪接体相关的非经典内含子样基序（AG-AN），其余则缺乏任何已知的内含子 motif。这些插入序列在成熟rRNA转录本中不存在，提示它们可能作为内含子被切除。这种基因组通过插入新序列而扩展的现象，与无色绿藻的非光合质体基因组以及绿藻虫（chlorarachniophytes）核形体中发现的18-23 bp剪接体内含子相似，可能是质体演化中“核形体化”（nucleomorphising）过程的一部分——即被保留的猎物核经历逐渐且无序的转化，伴随着随机基因组修饰。

硅藻基因表达谱向光合作用倾斜

对最高表达转录本的分析揭示了显著的功能重塑。在自由生活的 N. captiva 中，高表达基因仅少数与质体功能相关；相反，在两种双甲藻的ODPs中，高表达基因绝大多数编码光合作用相关或质体靶向蛋白。热图比较显示，自由生活硅藻中高表达的转录本在ODPs中相对丰度降至5%以下，而ODPs中高表达的光合作用相关基因其相对丰度较自由生活状态提高了3至1,616倍。这表明甲藻宿主创造了一个细胞内环境，在选择压力下上调了与光合作用相关的硅藻基因，即使是在临时维持状态下，这些硅藻也已被功能改造为宿主的光合作用细胞器。

质体与线粒体靶向基因的表达

靶向预测分析表明，与自由生活硅藻相比，两种双甲藻ODPs中编码质体靶向蛋白和线粒体靶向蛋白的转录本比例显著更高。这暗示在ODP状态下，编码非细胞器靶向蛋白的基因可能被抑制或丢失。对细胞器相关代谢途径的深入分析发现，与光系统（如 psbM, petB, psbO）、质体氧化应激响应（如超氧化物歧化酶）相关的转录本在ODPs中显著上调；而与铁应激（ flavodoxin）、光保护（玉米黄质环氧化酶）及糖酵解下游（如 PGAM）相关的基因则表达量降低。在线粒体功能方面，与丝氨酸生物合成相关的基因表达上调，而与TCA循环、呼吸复合体II（如琥珀酸脱氢酶）相关的基因表达减少，提示光合固碳可能被重新导向线粒体的丝氨酸合成途径。

光合产物从硅藻区室向宿主的运输

碳从ODPs向宿主甲藻的转移是内共生关系稳定的基石。研究聚焦于硅藻细胞质中的糖异生、硅藻特有的 vacuolar chrysolaminarin（金藻昆布多糖）代谢以及可能介导交换的碳水化合物转运蛋白。编码糖异生关键酶（如细胞质FBAI, FBAII, FBP）和chrysolaminarin合成/催化酶的基因在两种ODPs中均被检测到，且共聚焦显微镜（CLSM）证实了chrysolaminarin颗粒的存在。然而，这些基因在ODPs中的相对转录丰度比自由生活硅藻低了约10倍，表明硅藻细胞质中的糖异生和金藻昆布多糖合成减少，大部分磷酸丙糖（triose phosphate）可能被输出到宿主甲藻。

在宿主甲藻中，研究鉴定出三个推测的碳水化合物转运蛋白：质体磷酸丙糖转运蛋白（TPT，推测位于ER）、己糖磷酸转运蛋白（UhpC，推测位于质膜）和葡萄糖转运蛋白（GLUT，推测位于质膜）。其中，GLUT的表达水平比TPT高6-10倍，表明葡萄糖运输可能是一条重要的碳摄取途径。值得注意的是，UhpC转运蛋白仅在 D. kwazulunatalensis 中被检测到，提示具有永久整合ODPs的双甲藻可能进化出了额外的己糖磷酸运输系统。研究者因此提出一个模型：磷酸丙糖是通过TPT从硅藻质体输出的主要碳形式，而葡萄糖则作为替代运输路线，后者源于硅藻细胞质中chrysolaminarin的分解，通过GLUT运至甲藻细胞质后转化为己糖磷酸用于淀粉合成。

ODP细胞周期控制的机制

控制内共生体细胞分裂是从细胞器盗取（karyoklepty/cytoklepty）向永久整合质体迈进的关键一步。 D. capensis 只能暂时保留多个硅藻核数周，而 D. kwazulunatalensis 则能实现宿主甲藻与硅藻核分裂的同步化。

研究分析了39个在模式硅藻 Phaeodactylum tricornutum 中表征过的核心细胞周期调节基因。大多数基因在ODPs中的表达量与自由生活硅藻相当。然而，有五个基因在两种双甲藻ODPs中表现出一致的表达变化：APC10和CDKD1显著上调，而aureochrome 1a、APC3和bZIP10显著下调。后两者是驱动硅藻G1-S期转换的关键转录因子，它们的低表达可能抑制了ODP的细胞周期进程。特别值得注意的是，仅在 D. kwazulunatalensis 中，SKP1和RBX1基因显著上调，它们编码SCF（Skp1-Cullin-F-box）泛素连接酶复合物的关键组分，该复合物介导G1-S转换期间细胞周期调节子的靶向降解。SCF组分的上调，连同aureochrome 1a和bZIP10的显著下调，表明对G1-S转换的调控可能是控制ODP核分裂的关键。

此外，营养限制也可能影响ODP的细胞周期。与自由生活硅藻相比，ODPs中与硝酸盐和亚硝酸盐代谢相关的基因（如铁氧还蛋白-亚硝酸还原酶）表达更高，提示可能存在硝酸盐饥饿。而定位於硅藻质膜上的硝酸盐转运蛋白表达量较低，这与 symbiosome membrane（共生体膜）限制营养摄取的假设一致。磷酸盐转运蛋白的表达则无显著变化或降低，表明磷酸盐可用性可能不是限制因素。这些发现表明，G1-S转换的转录调控和硝酸盐可用性在控制ODP核分裂和质体永久整合的演化中扮演着关键角色。

结论

本研究揭示了双甲藻中质体整合的一个活体连续谱，填补了从临时细胞器保留到永久内共生之间的空白。研究表明，硅藻核在两种双甲藻中均保持转录活性，但越来越多地受到宿主的影响，并在 D. kwazulunatalensis 中 culminating 表现为基因组重组和代谢重编程。己糖磷酸输出通路的出现，以及类核形体转化的分子特征，标志着一个决定性的演化转折：从 accommodation（容纳）转向 assimilation（同化）。研究者还提出了一个宿主控制内共生体分裂的双重机制，将细胞周期调控与环境营养信号联系起来。通过这些发现，双甲藻确立了其作为研究复杂质体逐步驯化分子机制的罕见实验窗口的地位。