细胞血红素稳态调控网络的扩展机制：连接线粒体功能、能量代谢与铁生物学的新视野

本研究发现细胞内血红素（heme）稳态通过一个远超ALAS-1/HO-1直接调控的广泛网络实现，该网络整合了TCA循环、氧化磷酸化（OXPHOS）、铁代谢和线粒体功能，揭示了"血红素组"（hemome）动态调控细胞代谢的核心机制，为相关疾病治疗提供新视角。

　　

Significance

血红素是好氧生命不可或缺的含铁四吡咯化合物，其在线粒体中的合成机制虽已明确，但在细胞内的运输过程及其与整体细胞功能的联系仍属未知。本研究揭示了一个广泛的调控网络，将血红素的合成与降解过程同铁生物学、能量代谢、氧化磷酸化及线粒体健康紧密相连，由此呈现出一个动态的“血红素组”图景，它将血红素稳态的控制与细胞的整体代谢功能联系起来。这些结果为深入理解血红素稳态失衡如何影响细胞生理学，以及如何治疗与四吡咯功能障碍相关的疾病奠定了基础。

Abstract

铁结合四吡咯（血红素）对细胞功能和生物能量学的调控至关重要。血红素的生物合成、运输和降解过程负责线粒体中血红素的供应及其插入下游蛋白质的过程。尚未解决的是这些过程如何相互连接，以及当血红素浓度变化时，细胞恢复稳态的更广泛影响。我们通过一个互补机制的网络，证明了HEK293细胞对细胞内血红素变化具有广泛而协调的响应，这些机制远远超出了对血红素生物合成和降解的直接调控。这些响应将血红素稳态的变化与线粒体功能联系起来，包括三羧酸循环（TCA循环）和氧化磷酸化（OXPHOS）等核心代谢过程，以及与铁的控制和储存相关的酶。我们的研究结果证明了扰乱血红素稳态的深远后果，并揭示了细胞血红素组的复杂性。

Quantification of Cellular Heme Bioavailability.

研究首先使用荧光标记的血红素过氧化物酶传感器（mAPXmEGFP）来确立在不同细胞条件下血红素的整体生物利用度如何变化。该传感器在结合血红素后，其荧光寿命会缩短，这可用于从细胞图像中量化血红素的可用性。在HEK293细胞中，研究了改变血红素浓度的不同细胞培养条件：i) 通过添加琥珀酰丙酮（SA）抑制血红素生物合成，SA是血红素生物合成通路第二步PBGS的抑制剂；ii) 通过添加血红素（hemin）补充血红素浓度；iii) 通过添加锌原卟啉IX（ZnPP）抑制血红素降解，ZnPP是血红素加氧酶-1（HO-1）和血红素加氧酶-2（HO-2）的有效抑制剂。荧光寿命成像显微镜（FLIM）揭示了传感器在细胞中的发射寿命空间分布。不同条件下平均荧光寿命（τ_mean）值的广泛分布反映了局部血红素可用性的差异。不同孵育条件下获得的图像之间τ_mean众值的移动表明了细胞范围内生物可利用血红素的变化。具体表现为，与SA孵育的细胞中观察到较低的血红素水平（τ_mean分布上移）；相反，当用hemin或ZnPP补充时，观察到较高的血红素水平（τ_mean分布下移）。该分析是在每个条件单一时间点测量的，虽重要但未考虑各处理影响细胞响应的潜在不同且难以量化的时间尺度，这意味着初级效应（即直接由添加SA、heme或ZnPP引起）与次级效应（例如，由添加血红素直接导致的活性氧物种引起的氧化应激级联反应）未能解耦。

Measurement of Total Cellular Heme.

全血红素传感器mAPXmEGFP的形成取决于总细胞内血红素中有一部分可用于与传感器结合。这部分被认为是“可交换的”或“生物可利用的”血红素，其在细胞内松散结合，可用于结合伴侣之间的交换。可交换血红素是细胞中存在的总血红素的一个子集：虽然部分血红素不可逆地结合到血红素蛋白上或储存为疟色素（hemozoin）（因此无法与传感器结合），但可交换或生物可利用的血红素可用于调节或信号功能。为了探究图2B中显示的生物可利用血红素的测量变化是否伴随着总血红素的类似变化，使用荧光法测量了总细胞内血红素浓度（[Heme]_{per cell}）。在SA、hemin或ZnPP孵育的细胞中进行测量；这些数据显示，总血红素浓度比几种不同细胞系中报道的生物可利用血红素浓度高出多达四个数量级。与用SA抑制血红素生物合成的细胞相比，在用hemin或ZnPP孵育的细胞中观察到总细胞内血红素的显著增加。ZnPP孵育特别增强了总血红素的积累，这与ZnPP抑制HO-1和HO-2一致。然而，这并未伴随着生物可利用血红素的积累，表明存在独立于总血红素水平管理机制的控制生物可利用血红素水平的机制。

Quantification of the Reciprocal Regulation of ALAS-1 and HO-1.

在不同细胞条件下观察到的血红素水平变化，首先需要在血红素生物合成和降解调控的背景下理解。由于已知存在血红素生物合成和降解的相互反馈调节，我们评估了ALAS-1和HO-1的表达，以此解耦整体细胞响应。ALAS-1催化甘氨酸与琥珀酰辅酶A（Suc-CoA）缩合形成δ-氨基乙酰丙酸，是血红素生物合成通路中的第一个也是限速酶。HO-1是血红素加氧酶的可诱导形式，催化过量血红素的降解。使用HEK293细胞的全细胞裂解液来量化在不同血红素可用性条件下（同上）ALAS-1和HO-1水平的相对变化。在通过使用SA抑制血红素生物合成的条件下，ALAS-1被上调，但对HO-1水平没有显著影响。相反，在hemin存在下，ALAS-1被下调，而HO-1被上调。在ZnPP存在下，HO-1的上调更为明显，这也导致了ALAS-1表达的更大程度丧失。这些数据表明ALAS-1和HO-1蛋白共同响应细胞内血红素浓度的变化。在进一步的实验中，我们证明了如上所示的ALAS-1和HO-1表达水平对一系列SA和hemin浓度有响应。随着SA浓度（0.01至100 μM）的增加，ALAS-1水平呈现单调增加。随着hemin浓度（1至10 μM）的增加，观察到ALAS-1的单调减少伴随着HO-1的单调增加。总之，这些数据证明了负责血红素合成和血红素降解的关键血红素稳态蛋白之间存在动态相互作用，并且这种相互作用对生物可利用血红素浓度的变化有响应。

Quantitative Proteomics.

我们假设血红素生物合成和降解过程不太可能孤立运作。因此，我们试图识别比图2和图3所示更广泛的细胞内血红素水平变化的后果。对以同样方式用1 mM SA、10 μM hemin或10 μM ZnPP孵育的HEK293细胞的全细胞裂解液进行串联质量标签（TMT）蛋白质组学分析。每种条件下显著上调和下调的蛋白质数量如图所示。从这些数据中最直接的观察是，通过免疫印迹观察到的ALAS-1和HO-1的上调和下调模式在定量蛋白质组学分析中得到了重现，从而验证了该方法。使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)，可以在蛋白质组学数据中识别生物可利用血红素水平与细胞代谢功能分子之间更广泛的关系。IPA将显著变化的蛋白质列表与检测到的所有蛋白质列表进行比较，并识别与特定功能或通路相关的蛋白质簇是否显著富集。IPA进一步使用这些簇中蛋白质丰度的相对变化来预测激活或抑制。对于SA、hemin和ZnPP孵育，IPA输出的显著改变的生物通路（P < 0.05）分别进行了总结。值得注意的是，SA和hemin都影响了与能量生产相关的几种线粒体过程，如下所述。

在通过SA抑制血红素合成的细胞案例中，我们鉴定出NADH脱氢酶亚基和几种其他参与电子传递过程的蛋白质的下调，包括细胞色素c氧化酶亚基、细胞色素b₅和细胞色素bc1复合物。这与氧化磷酸化的整体失活一致。在血红素合成被抑制的条件下，核心代谢过程的这种破坏导致线粒体功能障碍，并伴随着线粒体生物发生的激活以及参与能量代谢整合的通路的激活。我们将其解释为，在SA存在下，生物可利用血红素的耗竭对基本的血红素依赖性线粒体过程（例如，氧化磷酸化）产生负面影响，并激活能量生产的辅助模式（线粒体生物发生和能量代谢整合）。

鉴于抑制血红素生物合成对氧化磷酸化的失活影响，我们试图测量细胞是否随后能够通过增加细胞外血红素摄取能力来补偿这一点。当在成像前立即用hemin处理表达mAPXmEGFP的对照细胞时，τ_mean在60分钟内降低，这与hemin摄取到细胞中一致。当细胞用SA预孵育时，添加hemin后τ_mean的众值出现更剧烈的下降，这与整体更高的细胞外血红素摄取一致。在一组平行实验中，HeLa细胞以同样方式用SA预孵育，并获得了类似的模式。然而，HeLa细胞在60分钟后始终显示出更高的血红素摄取，表明血红素摄取能力在不同细胞类型中有所不同，可能反映了不同的代谢特征和血红素需求。

转向增加血红素的影响，用hemin孵育也影响了几种线粒体过程，包括三羧酸（TCA）循环和线粒体生物发生。发现TCA循环通过异柠檬酸脱氢酶（IDH3A）和α-酮戊二酸脱氢酶组分4（KGD4）的下调而显著失活，两者都催化TCA循环中间体在Suc-CoA形成之前的转化，以及丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）的PDHA1、PDHB和PDHX亚基的下调，PDC将有氧产生的丙酮酸转化为进入TCA循环的乙酰辅酶A。与SA孵育的细胞案例一样，用hemin孵育也影响线粒体功能障碍。然而，在这种情况下，线粒体生物发生被失活，并伴随着线粒体嵴形成的破坏，表现为几个ATP合酶亚基的下调和Mic60 (IMMT)的上调，Mic60是线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）的核心组成部分。MICOS在促进铁螯合酶活性方面起着至关重要的作用，这对血红素生物合成至关重要。数据还确定了作为hemin孵育后果的对铁摄取和储存的直接影响。特别是，铁储存蛋白铁蛋白的重链被上调，而参与铁获取通路的两种蛋白质，STEAP-3和转铁蛋白受体（TfR），被下调。最后，鉴于已知的hemin毒性与谷胱甘肽（GSH）耗竭之间的相互作用，硫醇氧化还原状态的改变可能有助于观察到的蛋白质组变化。我们的通路分析确定了参与谷胱甘肽生物合成和谷胱甘肽氧化还原反应的蛋白质。虽然这支持了血红素与GSH之间可能存在串扰的概念，但从当前数据无法确定这些通路是被激活还是失活。提供了hemin和SA孵育均显著影响的通路的直接比较。

在所检查的三种条件中，ZnPP孵育导致显著受影响蛋白质的数量最多。ZnPP对血红素生物合成和降解表现出与hemin诱导的类似效果。然而，ZnPP独特之处在于对PPOX和FECH的上调，这是催化血红素生物合成最后两步的两种线粒体酶。与hemin相比，测量的HO-1上调更为明显。ZnPP对血红素加氧酶活性的抑制性作用阻止了HO-1减轻细胞内应激，并导致血红素积累，两者都与hemin相比HO-1诱导更强一致。因此，ZnPP的影响扩展到额外的氧化应激响应。这些应激响应主要由NRF2靶基因介导，其中包括BACH1（它是血红素依赖性的）和谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）。还鉴定了多种其他通路，与旨在支持细胞在应激下存活的响应一致。列表包括NRF1的下调、RNA的基因沉默、翻译后修饰（例如，SUMO化、泛素化），以及代谢通路的激活，如NAD信号传导和线粒体脂肪酸β-氧化。

Assessment of Mitochondrial Function.

使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT）测定法进一步评估了血红素浓度变化对线粒体过程的影响。MTT测定利用代谢活性细胞将单四唑盐还原为甲臜的显色性质，用于评估整体细胞代谢活性的变化，特别是在线粒体功能方面。在用SA、hemin或ZnPP孵育后，测量到甲臜产量减少，表明线粒体活性受损，其中hemin和ZnPP观察到的效果最大，与我们的蛋白质组学发现一致。

我们进一步部署流式细胞术来确定观察到的线粒体代谢活性变化是否伴随着线粒体质量的改变。使用线粒体染色测量中位荧光强度（MFIs）并评估每种孵育条件下线粒体质量的相对变化。抑制血红素生物合成与SA后未观察到显著变化。另一方面，hemin和ZnPP诱导测量的MFI相比对照下降20%至30%。这些数据表明细胞内四吡咯的积累可以降低线粒体质量。

Discussion

在过去的十年中，在使用荧光报告基因追踪细胞中血红素的位置和浓度方面取得了进展。这揭示了在孤立实例中单一时间点的细胞内血红素浓度，并揭示了不同细胞系之间存在显著差异（报告范围从低nM到mM）。这些差异表明血红素的可用性是高度动态的，并对细胞的即时需求有响应。清楚的是，荧光血红素报告基因本身尚不能捕捉这种不断变化的局部细胞环境的复杂性。因此，在本文中，我们采取了不同的方法，通过研究血红素丰度扰动的控制方式，以及这些响应如何与更广泛的细胞平衡维持相联系。

第一个观察结果是，荧光寿命成像数据提供了证据，证明在预期血红素浓度会降低（当血红素生物合成被抑制时）或增加（当细胞提供血红素或当血红素降解被抑制时）的条件下，局部血红素生物利用度存在波动。然而，只有用ZnPP孵育的细胞显示出总血红素（定义为细胞中可逆和不可逆结合到血红素结合蛋白上的血红素总量）的显著积累。这意味着，在我们的实验中，不同血红素暴露条件下生物可利用血红素的变化不一定影响细胞中血红素的总配额。从这些数据中得出的实质性结论是，细胞对血红素丰度变化存在动态响应，并且存在不同层次的控制来维持适当的总体血红素水平。这种整体控制的一部分是由提供血红素的ALAS-1和去除它的HO-1的互补响应提供的——这意味着血红素生物合成和血红素降解过程之间存在紧密耦合的协调，ALAS-1和HO-1作为细胞内血红素水平的天然传感器和调节器协同工作。

超越血红素生物合成和降解调控的直接性，我们识别出对血红素稳态变化的更广泛响应。数据确定了血红素丰度波动与一系列参与线粒体功能、能量代谢和铁调节的蛋白质之间的直接联系，证明血红素稳态与其他核心通路相整合。具体来说，生物可利用血红素的耗竭通过影响电子传递链的几个亚基导致线粒体功能障碍和氧化磷酸化受损。后一种效应通过辅助能量生产模式的激活以及细胞外血红素摄取能力的增加得到补偿，我们将其解释为对可用于氧化磷酸化等过程的血红素水平降低的响应。

也许最引人注目的是，确定了血红素水平增加与TCA循环失活之间的直接联系。TCA循环的失活限制了ATP生产，与代谢重编程相关，并导致用于生物合成功能的关键代谢物池（例如，脂肪酸、氨基酸和核苷酸合成）失衡。在血红素合成的背景下，TCA循环提供Suc-CoA（ALAS-1的底物），因此，Suc-CoA将变得更加有限。我们将其解释为证据，表明血红素稳态可以通过限制用于血红素生物合成的Suc-CoA供应来控制。这种与TCA循环的联系强调了血红素对线粒体活动的中心地位，并证明了通过微调作为ALAS-1底物的Suc-CoA的供应来调节非红细胞中的血红素生物合成。我们注意到，琥珀酰辅酶A合成酶在调节血红素生产中的作用早在1965年就被提出；后来，发现了琥珀酰辅酶A合成酶与ALAS-2（红细胞特异性ALAS同工型）之间的相互作用，但与ALAS-1无关。然而，最近的研究——包括这项研究——强调了这种相互作用的组织特异性调节。更普遍地说，血红素水平的增加——无论是通过hemin还是ZnPP孵育——导致线粒体质量的 measurable 减少。这与通路分析一致，通路分析确定了在过量血红素存在下线粒体生物发生和嵴形成的失活，导致产生更少的功能性线粒体。总体而言，在过量血红素和高细胞内铁存在下，线粒体质量的减少将限制活性氧物种的产生和氧化应激，正如血红素水平增加时出现铁过载缓解策略所证明的那样。细胞内血红素水平和氧化应激的变化密切相关，已知活性氧物种会激活转录因子，如Nrf2 (NFE2L2) 和 HIF-1α。ZnPP孵育导致这些通路的激活，与由于抑制HO-1/2导致血红素积累引起的氧化应激增加一致。相反，hemin孵育并未显著改变Nrf2和HIF-1α通路，表明HO-1的细胞保护活性（在功能正常时）可以减轻血红素过载和氧化应激。HO-1基因的转录控制参与广泛应激条件的适应性细胞响应，这些条件不限于 increased heme levels。与hemin相比，ZnPP诱导的HO-1上调可能因竞争血红素结合位点、抑制血红素降解导致的血红素积累以及增加的氧化应激而放大，在ZnPP存在下有限的胆红素生产可能加剧了氧化应激。ZnPP的独特之处在于其对血红素生物合成的影响，这超出了ALAS-1的下调，还包括PPOX和FECH的 measurable 上调。重要的是，ALAS-1、PPOX和FECH是三种线粒体酶，它们在 mitochondria 中催化各自的血红素合成步骤（血红素合成通路的其余部分发生在细胞质中）。这与这三种线粒体血红素合成酶与线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）物理相关一致，MICOS被证明受到hemin孵育的影响。由于hemin影响ALAS-1和Mic60（一个关键的MICOS亚基）但不影响PPOX，并且FECH独特地受ZnPP影响而不受hemin影响，线粒体血红素代谢组各个组分之间的翻译调控相互作用显得复杂。意义在于，这些数据将生物可利用血红素细胞内水平的波动与影响线粒体功能和结构的机制联系起来。

从细胞稳态的整体角度来看，本研究的结果突显了一个广泛且连接良好的调控网络，它远远超出了对合成或降解的血红素量的直接干预。相反，血红素稳态通过将其调控整合到TCA循环和氧化磷酸化等初级代谢通路、一般线粒体功能以及铁储存和动员的调控中，涉及多层次的控制。未来进一步探索中心代谢与血红素生物合成、运输和降解之间的这种相互作用，将为临床干预提供机会，这些临床情境中血红素稳态的动态直接受到破坏（例如，卟啉症、恰加斯病、疟疾）和/或知之甚少（例如，心血管生理学、癌症）。