菌落形态转变在脓肿分枝杆菌基因必需性中的关键作用

本研究利用转座子插入测序技术揭示脓肿分枝杆菌（MAB）从光滑型（MABS）向粗糙型（MABR）转变过程中基因必需性的显著差异，发现形态特异性必需基因在体外和小鼠感染模型中具有独特功能，部分基因被列为治疗靶点，强调形态转换在靶点优先性评估和治疗策略开发中的重要性。

　　

研究背景

细菌在慢性人类感染过程中常通过改变外表面对宿主环境进行适应，这种适应常表现为琼脂平板上菌落形态（morphotype）的改变。在人类病原体脓肿分枝杆菌（Mycobacteroides abscessus, MAB）中，从光滑（MAB^S）到粗糙（MAB^R）形态的单向转变在慢性感染中频繁发生，这一转变具有深刻的临床意义，因为MAB^R会诱导更强的促炎反应，导致发病率增加。为深入理解这一现象，研究团队采用转座子插入位点测序（Tn-seq）技术，系统鉴定了MAB^S和MAB^R生存所必需的基因。

构建与分析MAB^S和MAB^R突变体文库

研究以MAB标准菌株ATCC 19977为模型，该菌株属于优势循环克隆1复合体（DCC1），与20%的MAB感染相关。从ATCC获取的菌株中分离出光滑和粗糙形态的单菌落，全基因组测序显示MAB^R在MAB_4098c（编码Mps2，一种参与糖肽脂（GPL）合成的非核糖体肽合成酶）中存在单碱基缺失，导致移码突变。利用MycoMar噬菌体携带的HiMar1 Mariner转座子，在MAB^S和MAB^R中构建了转座子突变体文库。在ATCC 19977基因组的91,449个潜在TA插入位点中，MAB^S和MAB^R文库分别有41,130和54,603个位点被占据，平均每93至123 bp有一个插入。通过计算流程（比较观察到的突变体频率与零模型下的模拟数据），结合22个细菌通用必需基因的统计参数，定义了必需基因。分析共识别出304个必需基因，其中297个（98%）是基于34个全球代表性基因组泛基因组分析的核心基因。

MAB形态具有独特的基因需求

分析发现，MAB^S和MAB^R分别有79和65个独特的必需基因。通过差异转座子频率分析（优先处理形态间频率变化超过4倍且P < 0.05的基因），MAB^S和MAB^R的特异必需基因数量缩减至13和47个。进一步生长实验显示，47个MAB^R必需基因中的33个在MAB^S中经过额外生长后出现适应性缺陷，而13个MAB^S必需基因中的7个在MAB^R中未显示显著适应性缺陷。研究最终聚焦于21个基因（14个MAB^R和7个MAB^S）进行验证，这些基因在一种形态中必需，在另一种形态中对适应性影响有限。

验证独特必需基因

利用CRISPR干扰（CRISPRi）技术，研究团队测试了部分形态特异性必需基因。引导RNA（sgRNA）靶向诱导后，通过碟片扩散实验评估生长抑制。对照实验证实，靶向RNA聚合酶β亚基（rpoB）的sgRNA在两种形态中均完全抑制生长，而缺乏sgRNA的Cas9诱导无效果。针对6个MAB^S和4个MAB^R特异性必需基因的CRISPRi实验，除MAB_3673（编码琥珀酸脱氢酶2亚基C，sdh2C）外，均重复了Tn-seq结果。sdh2C在MAB^S中必需，但在MAB^R中诱导后虽出现生长抑制，抑制区内却出现大量菌落，测序发现这些菌落携带MAB^R基因组上的抑制突变，而非CRISPRi质粒突变。

研究还验证了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶A和B（pknA和pknB）。pknB在两种形态中均必需，而pknA仅在MAB^R中必需。qRT-PCR显示转录本丰度在两种形态中无差异，排除CRISPRi效率或极性效应的影响。进一步在临床分离株（来自囊性纤维化患者）中验证，pknA的CRISPRi在MAB^R中导致清除区和生长减少，而在MAB^S中无此现象，表明pknA对MAB^R适应性的重要性不限于ATCC 19977菌株。

MAB两种形态均可建立皮肤脓肿感染

研究团队开发了小鼠脓肿模型，将10⁷ MAB^S或MAB^R注射到瑞士Webster小鼠大腿内侧，72小时后收集脓肿。此时，MAB^R感染脓肿重量更大，但细菌负荷无显著差异；然而，MAB^R导致脾脏播散显著增加。细胞因子和趋化因子分析显示，与PBS对照相比，MAB^R感染脓肿中促炎标志物（TNF-α、IL-1β、IL-6和中性粒细胞趋化因子CXCL1）水平升高，表明MAB^R在该模型中诱导促炎反应，与其他感染模型一致。

形态在脓肿感染中需要独特的必需基因

将MAB^S或MAB^R转座子文库接种小鼠，3天后分析脓肿中突变体频率。首先评估体外独特必需基因在脓肿中的重要性，7个MAB^S独特必需基因的突变均在MAB^R脓肿感染中导致适应性缺陷；14个MAB^R独特必需基因中，仅ribD和argB在MAB^S脓肿感染中无适应性缺陷。为验证体内结果，构建了MAB^S pknA缺失突变体，与野生型MAB^S相比，脓肿中CFUs减少18倍，与Tn-seq数据（28倍减少）一致。

接下来识别脓肿感染中新的独特必需基因，聚焦于4,083个非体外必需基因。分析发现，MAB^S和MAB^R分别有215和97个独特必需基因，52个基因在两种形态中均新定义为必需。MAB^S独特必需基因包括与慢性感染建立相关的基因（如doxX、rpfA、esxU）、重组相关基因（recR、Holliday连接修复蛋白）和硫代谢基因。MAB^R需要应激反应相关基因（如clpB、whiB2、tetX、phoH）和DNA损伤应答基因（recF、甲基化DNA蛋白半胱氨酸甲基转移酶）。

MAB^S感染期间的免疫激活导致必需基因趋同

已知宿主对MAB^R和MAB^S感染反应不同，对MAB^R的促炎反应增强。为测试这种差异免疫反应是否导致脓肿中形态特异性必需基因，研究在MAB^S转座子文库存在下，诱导MAB^R样免疫反应（通过共接种热灭活MAB^R或TLR2激动剂PAM3CSK）。仅热灭活MAB^R共接种导致IL-1β、TNFα、IL-6和CXCL1显著增加。在此条件下，MAB^S中108个基因变为必需，包括16个在MAB^R脓肿中独特的必需基因（如编码组氨酸激酶MtrB的MAB_3590c、缺氧应答基因MAB_2606c、抗反应性亚胺中间体基因ridA同源物MAB_2910c）。为验证这些发现，在MAB^S中构建MAB_3590c和MAB_2606c缺失突变体，与野生型MAB^S在热灭活MAB^R存在下竞争，两种突变体均显示适应性缺陷。这些数据表明，MAB^R样免疫反应诱导导致16个MAB^R独特必需基因在MAB^S脓肿感染中变为必需，表明免疫反应对部分（非全部）形态特异性必需基因差异负责。

讨论

在慢性人类感染中，MAB常从光滑向粗糙形态转变，本研究显示这一转变改变体外和体内适应性所需基因。GPL缺失是形态间主要差异，也是基因需求变化的简单解释。GPL对形态特异性基因必需性的影响得到其他分枝杆菌研究的支持，例如sdh2C在含GPL的耻垢分枝杆菌中必需，而在缺乏GPL的结核分枝杆菌中非必需；pknA在MAB^R中必需，而在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中均必需，表明某些基因的必需性与GPL存在相关。GPL位于分枝杆菌外部，可能影响MAB感知和响应环境信号的方式。MAB^R比MAB^S具有更多必需基因，许多编码细胞壁生物合成和应激应答功能，表明GPL缺失可能影响MAB感知环境应激（许多在感染期间发生）的方式。

本研究生成的Tn-seq数据对开发治疗MAB感染的新疗法至关重要。噬菌体疗法对MAB^R有效，但对MAB^S无效，除GPL存在/缺失外，其他生理因素可能贡献噬菌体杀灭。形态特异性必需基因可能揭示MAB^S抵抗噬菌体杀灭的原因。此外，重新利用抗结核药物（如靶向PknA和PknB的小分子抑制剂）可能有效，尽管pknA在MAB^S体外非必需，但其突变在两种形态脓肿中均导致适应性缺陷，表明PknA抑制剂在人类感染中可能有效。

尽管非囊性纤维化肺感染模型，脓肿模型可处理、允许每鼠两个脓肿，满足研究日益突出的人类肺外感染的需求。在该模型中，MAB^R诱导更多炎症，需要适应应激的重要基因，许多对MAB^S在小鼠脓肿中适应性不重要。暴露MAB^S于MAB^R样免疫反应显示，97个MAB^R独特必需基因中的16个可能是对粗糙形态促炎反应的结果，表明大部分MAB^R独特必需基因不受免疫反应介导，可能受感染部位营养/物理环境影响。出乎意料的是，MAB^S在脓肿中比MAB^R有更多必需基因，表明尽管宿主对MAB^S反应促炎性较低，光滑形态在体内生存需要更多功能。这些独特MAB^S体内必需基因可能提供线索，理解慢性人类感染中MAB^S向MAB^R转变的选择压力。

最后，值得注意的是，本研究对Tn-seq数据分析非常保守，可能遗漏体外和体内适应性的关键基因。更长期感染研究对全面确定MAB在该模型及其他小鼠模型中慢性感染所需基因至关重要。基于对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在多种动物模型中的研究，预期脓肿模型中识别的许多必需基因在其他小鼠模型（包括更常用肺模型）中对适应性重要。这些数据强烈支持研究两种形态的基因必需性和治疗开发，确保最大疗效。