人鼻上皮类器官揭示微生物定植的差异性与细胞因子应答机制：从病原体到共生体的黏膜免疫调控新视角

本研究发现人鼻上皮类器官（HNOs）在气液界面（ALI）分化后可精准模拟鼻腔黏膜环境，成功构建了金黄色葡萄球菌（S. aureus）、肺炎链球菌（S. pneumoniae）及惰性乳球菌（D. pigrum）的单一定植模型。该模型揭示了病原体与共生体差异性地激活IL-1家族炎症小体（inflammasome）信号通路，并特异性调控CXCL10/CXCL11等趋化因子表达，为鼻腔微生物-上皮互作机制研究提供了突破性实验平台。

　　

人类鼻上皮类器官在气液界面分化形成功能性黏膜层

通过克拉克固定液结合高碘酸-雪夫（PAS）和苏木精染色证实，分化成熟的人鼻上皮类器官（HNOs）在气液界面（ALI）培养条件下可形成具有纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞的多层上皮结构，并产生丰富的顶端黏液层。该黏液层对细菌行为具有关键调控作用，可减少细菌黏附与生物膜形成。实验采用34°C培养条件（模拟人类鼻腔温度），发现温度转换对HNOs转录组影响微弱，表明其生理稳定性。

三种鼻腔微生物在HNOs中实现差异化定植

研究采用三种代表性鼻腔微生物：致病菌金黄色葡萄球菌（USA300 MRSA株JE2）、肺炎链球菌（603株）和潜在共生菌惰性乳球菌（KPL3065株）。接种10⁷ CFU细菌后，HNOs表现出物种特异性的定植动力学：金黄色葡萄球菌在24小时下降500倍后出现增殖反弹；惰性乳球菌持续下降；肺炎链球菌保持较高菌量。线性混合效应模型（LMM）分析显示不同供体来源的HNOs间变异度低于2.8%，证明模型稳定性。

细菌定植局限于黏液层且不引起显著上皮损伤

通过Mitotracker Red荧光标记结合抗MUC5AC抗体染色，发现所有三种细菌均主要定植于顶端黏液层，与未定植对照组相比无显著上皮结构破坏。乳酸脱氢酶（LDH）释放实验表明，惰性乳球菌和肺炎链球菌定植组的细胞损伤水平与对照组相当，而金黄色葡萄球菌定植仅引起3.5倍的轻微LDH升高，证明HNOs对微生物定植具有良好耐受性。

HNOs相比传统细胞系更具生理相关性

与肺癌来源的Calu-3细胞和鼻中隔鳞癌来源的RPMI 2650细胞相比，HNOs具有更完整的黏液分泌功能（MUC5AC阳性）、纤毛结构（乙酰化α-tubulin阳性）和基底细胞层（KRT5阳性）。尽管三种模型在6小时定植实验中表现出相似的细菌载量和LDH释放水平，但HNOs在细胞类型组成和黏液层结构方面更接近体内鼻腔上皮的生理状态。

微生物定植诱发特异性细胞因子应答

通过39种细胞因子检测发现：

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  金黄色葡萄球菌独家激活IL-1家族炎症反应：IL-1α（ apical 39倍/ basal 33倍）、IL-18（23倍）和IL-1RN（IL-1受体拮抗剂）显著上调，且活菌特异性诱导IL-1R信号通路激活
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  惰性乳球菌（活/死菌）和活金黄色葡萄球菌显著抑制CXCL10（IP-10）表达
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  死肺炎链球菌显著诱导CXCL10（ basal ）和CXCL11（ apical ）产生
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  所有细菌均普遍诱导G-CSF（粒细胞集落刺激因子）和CCL20（MIP-3α）表达
  值得注意的是，定植未引发I型干扰素反应，符合共生状态而非感染的特征。

讨论与展望

本研究首次建立HNOs-ALI模型用于鼻腔微生物定植研究，填补了原代上皮细胞（pHNECs）寿命短和癌细胞系生理相关性不足的空白。研究发现金黄色葡萄球菌通过炎症小体信号激活上皮免疫应答，惰性乳球菌可能通过抑制CXCL10参与免疫调节，肺炎链球菌则呈现促炎特征。未来可应用于：①菌株变异研究 ②多物种共定植模型 ③结合免疫细胞共培养 ④疾病特异性模型（如囊性纤维化） ⑤基因编辑机制研究。该模型符合FDA现代化法案2.0指导原则，为替代动物模型提供了重要平台。

研究方法包括：3D类器官扩增、ALI分化培养、γ射线灭菌（4,322 Gy）、转录组测序（Novogene NovaSeq 6000）、Luminex多因子检测、荧光显微成像（Olympus IX83）等。统计学分析采用R语言lme4包进行线性混合效应模型建模，并通过错误发现率（FDR）校正多重检验。