三种不同厌氧培养基对主要瘤胃细菌的选择性培养与富集研究及其在提升反刍动物消化效率和减少甲烷排放中的意义

本综述系统探讨了利用Med10、Med2和MedTC三种厌氧培养基对瘤胃微生物进行选择性培养与富集的效果。研究通过16S rDNA测序和生物信息学分析，揭示了不同培养基对Bacillota（厚壁菌门）、Bacteroidota（拟杆菌门）等关键菌群的选择性富集特性，并发现培养微生物群落与原始瘤液存在显著差异。该工作为靶向调控瘤胃微生物组、提升反刍动物饲料转化效率及减少甲烷（CH4)排放提供了重要的实验依据和培养基优化策略。

　　

摘要

反刍动物在全球粮食安全中扮演重要角色，但其瘤胃微生物发酵产生的甲烷（CH₄）也是温室气体的重要来源。瘤胃微生物群落对宿主从植物性饲料中获取能量效率具有决定性影响，并伴随甲烷副产物的生成。尽管宏基因组测序技术已组装出数千个新型微生物基因组，但其可培养性仍不明确。本研究采用三种厌氧培养基（Med10、Med2和MedTC）从瘤胃液中分离微生物共培养物，通过16S rDNA测序和生物信息学分析，揭示了不同培养基对特定微生物类群的选择性富集作用，并与原始瘤胃液微生物组成进行对比，为靶向培养关键功能微生物提供了理论依据。

材料与方法

样品收集与微生物培养

瘤胃液样品采集自四头瘘管安装的泽西奶牛，这些奶牛年龄在5-12岁之间，自由采食多年生黑麦草并辅以大蒜舔砖。瘤胃液通过瘘管采集后，经两层纱布过滤，并在39°C条件下保存。将瘤胃液用厌氧稀释液进行系列稀释至10^?2浓度后，分别接种到三种培养基（Med10、Med2和MedTC）中，每种培养基设置5个重复，共获得60个培养物。培养基制备在严格厌氧条件下进行，使用100% CO₂气体环境，并通过高压灭菌和过滤除菌确保无菌条件。

DNA提取与测序

培养物和原始瘤胃液样品经过离心收集菌体沉淀，采用改良的Qiagen DNA提取试剂盒进行DNA提取。16S rDNA V4区域使用条形码引物进行PCR扩增，扩增产物经纯化、定量和混合后，通过Illumina MiSeq平台进行双端测序。测序数据采用Mothur和Phyloseq等工具进行生物信息学分析，包括OTU聚类、分类学注释和多样性计算。

统计分析

通过α多样性（Observed、Shannon、Simpson指数）和β多样性（加权UniFrac距离）分析不同培养基和样品来源的微生物群落差异。使用ANOVA、PERMANOVA和Kruskal-Wallis等统计方法检验组间显著性，并通过事后检验分析具体差异。

结果

微生物在不同培养基上的生长情况

Med10和Med2培养基在48小时内显示出较高的光学密度（OD）增长，分别达到0.98±0.10和1.97±0.05，而MedTC培养基因成分沉淀导致OD值较低且变异较大（0.36±0.19）。尽管如此，肉眼仍可观察到MedTC培养基中的细菌生长现象。

培养微生物的组成特征

经过数据过滤和筛选，最终保留了34个OTU，分属于5个门和20个属。其中，Bacillota（75.28±6.34%）和Bacteroidota（19.99±4.85%）是培养物中最优势的门水平分类单元。属水平上，Selenomonas（28.08±11.71%）、Streptococcus（22.67±6.06%）、Prevotella（18.71±4.02%）和未分类的Lachnospiraceae（11.50±2.54%）占据主导地位。

培养基对微生物的选择性富集

α多样性分析表明，Med2和MedTC培养基在Observed、Shannon和Simpson指数上均存在显著差异（P<0.01）。β多样性分析进一步证实了不同培养基间微生物群落的显著分离（P=0.03），其中Med2和MedTC的差异最为明显（P=0.001）。31个OTU在至少一种培养基中表现出显著富集，表明不同培养基对特定微生物具有选择性。

原始瘤胃液与培养微生物的对比

原始瘤胃液以Bacteroidota（52.53±5.10%）和Bacillota（41.00±3.96%）为主，同时含有一定比例的Methanobacteriota（5.12±1.94%）和Pseudomonadota（1.22±0.78%）。与培养物相比，瘤胃液中的微生物组成更为复杂，且培养物中Methanobacteriota和Bacteroidota的相对丰度显著降低，而Bacillota和Actinomycetota则显著富集。

讨论

本研究通过三种常用厌氧培养基成功培养了34种瘤胃微生物，并揭示了培养基成分对微生物选择性富集的显著影响。Med2培养基富含简单碳水化合物和乳酸钠，促进了Selenomonas和Streptococcus等糖类和乳酸利用菌的生长；MedTC培养基则因含有血红素等特殊成分，对Prevotella等菌株具有特异性富集作用。这些发现表明，通过优化培养基成分，可以靶向培养具有特定代谢功能的瘤胃微生物。

与原始瘤胃液相比，培养微生物群落中Bacteroidota和甲烷菌（Methanobacteriota）的相对丰度显著降低，而Bacillota和Actinomycetota则过度代表。这一差异反映了当前培养技术的局限性，许多关键功能微生物（如高效纤维降解菌和甲烷菌）仍难以在体外培养条件下存活和增殖。

本研究培养的微生物中，Selenomonas、Streptococcus、Prevotella和Lachnospiraceae等类群与反刍动物饲料效率、甲烷产量和健康状态密切相关。例如，Selenomonas参与丙酸生成途径，可能有助于减少甲烷排放；Streptococcus某些菌株产生的细菌素可用于防控乳腺炎和瘤胃酸中毒；Prevotella则通过促进丙酸生成间接抑制甲烷产生。这些功能微生物的分离和鉴定，为开发微生态制剂、优化饲料配方和减少温室气体排放提供了重要资源。

尽管本研究在培养基设计和微生物培养方面取得了进展，但仍存在样本来源单一（仅泽西奶牛）、稀释效应（10^?2稀释可能遗漏低丰度微生物）和数据库分类准确性等限制。未来研究应拓展动物品种和饲料类型，结合宏基因组学和培养组学技术，进一步挖掘未培养微生物的资源潜力。

重要性

本研究证实了通过多样化培养基成分可以实现关键瘤胃微生物的选择性培养和富集。不同培养基对特定微生物类群的选择性富集特性，为今后靶向分离和功能研究提供了重要工具。此外，培养微生物与原始瘤胃液微生物组成的显著差异，突出了当前培养技术的不足，并强调了开发新型培养策略的必要性。这些研究成果不仅有助于深化对瘤胃微生物生态功能的理解，也为提高反刍动物生产效率和减少环境排放提供了科学依据。