鉴定HSV-2 UL13蛋白激酶的病毒激活因子UL55和Us10及其在α疱疹病毒CHPK调控中的新机制

本研究发现单纯疱疹病毒2型（HSV-2）的保守疱疹病毒蛋白激酶（CHPK）UL13在哺乳动物细胞中单独表达时无法有效磷酸化延伸因子1δ（EF-1δ），需依赖病毒辅因子UL55（主要激活因子）和Us10（辅助激活因子）才能发挥完整激酶活性。通过Co-IP、体外激酶实验和感染细胞模型，研究证实UL55和Us10与UL13互作并显著增强其自磷酸化及底物磷酸化能力。基因敲除实验进一步显示，UL55缺失会大幅降低HSV-2在U2OS细胞中的复制和细胞间传播，效果与UL13激酶失活突变相当，而Us10缺失影响较小。该研究揭示了α疱疹病毒CHPK调控的新机制，为理解病毒激酶功能进化及开发抗病毒策略提供了重要依据。

　　

引言

疱疹病毒科（Herpesviridae）病毒根据分子和生物学特性分为α、β和γ三个亚科。尽管这些病毒在致病性和临床表现上存在差异，但其基因组均编码一系列保守病毒蛋白，这些蛋白在疱疹病毒的生命周期中扮演着基础而通用的角色。疱疹 simplex 病毒2型（HSV-2）作为α疱疹病毒亚科成员，编码UL13蛋白激酶，这是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是疱疹病毒科中保守的病毒蛋白之一。这些保守的病毒蛋白激酶被称为保守疱疹病毒蛋白激酶（CHPK），包括α疱疹病毒亚科的HSV-1 UL13和水痘-带状疱疹病毒（VZV）ORF47，β疱疹病毒亚科的人巨细胞病毒（HCMV）UL97和人疱疹病毒6A、6B和7（HHV-6A、HHV-6B、HHV-7）U69，以及γ疱疹病毒亚科的Epstein-Barr病毒（EBV）BGLF4和Kaposi肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）ORF36。CHPK在病毒复制和致病性的多个方面具有重要作用，突显了它们在疱疹病毒生命周期中的重要性。

CHPK据报道与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）在功能和调控上具有相似性，因此也被称为病毒CDK样激酶。积累的证据表明，CHPK靶向多个CDK磷酸化位点，并且疱疹病毒科三个亚科中代表性CHPK的GxGxxG基序内保守酪氨酸残基的磷酸化负调控其激酶活性，类似于CDK中观察到的调控磷酸化。然而，先前对CHPK的CDK样功能的研究导致了相互矛盾的解释，特别是对于α疱疹病毒的CHPK。因此，据报道，在HSV-1或HSV-2感染的细胞中，UL13磷酸化细胞翻译延伸因子1δ（EF-1δ）的CDK1磷酸化位点（Ser-133）。在哺乳动物细胞中单独表达这些病毒蛋白激酶可诱导该位点的磷酸化，这表明CHPK的CDK样功能在疱疹病毒科的所有亚科中都是保守的。相反，在哺乳动物细胞中单独表达CHPK时，磷酸化细胞视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）和无菌α基序及HD结构域1（SAMHD1）中CDK靶点的能力是β和γ疱疹病毒CHPK所共有的，但α疱疹病毒的CHPK则不具备。目前尚不清楚这些差异是由于CHPK底物特异性的不同，还是由于实验系统的差异，例如病毒感染背景下的CHPK表达与哺乳动物细胞中的瞬时表达。

本研究旨在解决这些矛盾。尽管有报道称在HSV-2感染的细胞中，EF-1δ的Ser-133发生磷酸化，但本研究证明在哺乳动物细胞中单独表达HSV-2 UL13不足以诱导EF-1δ Ser-133的磷酸化，这与先前对Rb和SAMHD1的观察结果相似，它们在哺乳动物细胞中单独表达α疱疹病毒CHPK时也未发生磷酸化。这些发现使我们假设HSV-2 UL13可能需要一个或多个病毒辅因子来展现完整的激酶活性。为了识别这些辅因子，我们筛选了HSV-2的被膜蛋白，并发现UL55和Us10作为HSV-2 UL13的病毒激活因子。

结果

单独表达HSV-2 UL13和VZV ORF47在COS-7细胞中不足以诱导EF-1δ Ser-133的磷酸化

为了检验在哺乳动物细胞中单独表达CHPK是否能诱导EF-1δ Ser-133的磷酸化，将猿肾上皮COS-7细胞转染表达Flag标签的EF-1δ与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白[EGFP-EF-1δ(F)]的质粒，并结合表达带有Strep标签的野生型CHPK（SE-CHPK）的质粒，然后使用对EF-1δ Ser-133磷酸化特异的单克隆抗体（EF-1δ-S133

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）进行免疫印迹。当单独表达来自β和γ疱疹病毒的SE-CHPK，包括HCMV SE-UL97、HHV-6B SE-U69、EBV SE-BGLF4和KSHV SE-ORF36时，在Ser-133处磷酸化的EGFP-EF-1δ(F)的信号强度增加，但来自α疱疹病毒的HSV-2 SE-UL13和VZV SE-ORF47则不然。值得注意的是，HSV-2 SE-UL13的信号强度似乎高于HCMV SE-UL97、EBV SE-BGLF4和KSHV SE-ORF36，并且VZV SE-ORF47的信号强度与HCMV SE-UL97相当。然而，这些α疱疹病毒SE-CHPK在单独表达时不足以诱导EF-1δ Ser-133的磷酸化。这些结果与早期的观察结果一致，即β和γ疱疹病毒的CHPK，而非α疱疹病毒的CHPK，在哺乳动物细胞中单独表达时可以诱导Rb和SAMHD1中CDK靶点的磷酸化。这些结果，加上早期发现HSV-2 UL13在感染细胞中可以诱导EF-1δ Ser-133的磷酸化，使我们假设UL13可能需要病毒辅因子来展现完整的激酶活性，并促使我们识别这些辅因子。

识别HSV-2 UL13的病毒激活因子

据报道，CHPK被包装进病毒粒子的被膜中，这是一个位于核衣壳和包膜之间的无定形区室，包含20多种不同的病毒蛋白。据认为，被膜中的CHPK在新感染细胞的胞质中释放，在病毒进入后立即为病毒复制建立有利条件。鉴于这一点，HSV-2 UL13的病毒辅因子很可能位于被膜区室内。基于这些观察，我们聚焦于HSV-2被膜蛋白，并筛选它们以尝试识别激活UL13的病毒辅因子。

将COS-7细胞转染表达EGFP-EF-1δ(F)的质粒，连同表达SE-UL13的质粒，并结合表达22种不同被膜蛋白与EGFP融合的质粒，然后使用抗EF-1δ-S133

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抗体进行免疫印迹。在测试的被膜蛋白中，只有UL55和Us10在与SE-UL13共表达时显著增强了在Ser-133处磷酸化的EGFP-EF-1δ(F)的信号强度。在本研究中，我们未检验被膜蛋白组合对UL13的影响。

为了验证Us10是否增强由UL13介导的EGFP-EF-1δ(F)在Ser-133的磷酸化，将COS-7细胞转染表达EGFP-EF-1δ(F)的质粒，连同表达SE-UL13或SE-UL13-K176M（UL13的激酶失活突变体）的质粒，结合表达HA标签的Us10（HA-Us10）的质粒，然后使用抗EF-1δ-S133

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抗体进行免疫印迹。通过SE-UL13与HA-Us10的共表达，在Ser-133处磷酸化的EGFP-EF-1δ(F)的信号强度显著增强，但通过SE-UL13-K176M与HA-Us10的共表达则未增强。为了确定UL55是否类似地增强由UL13介导的EGFP-EF-1δ(F)在Ser-133的磷酸化，我们尝试使用表达HA-UL55的质粒进行类似实验。然而，我们注意到HA-UL55的信号几乎检测不到。这表明在COS-7细胞中HA-UL55的表达可能不稳定，可能是由于蛋白酶体介导的病毒蛋白降解。因此，将COS-7细胞转染表达EGFP-EF-1δ(F)的质粒，连同表达SE-UL13或SE-UL13-K176M的质粒，结合表达HA-UL55的质粒，并用蛋白酶体抑制剂MG132或其溶剂对照DMSO处理。然后使用抗EF-1δ-S133

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抗体对细胞进行免疫印迹。通过SE-UL13与HA-UL55的共表达，在Ser-133处磷酸化的EGFP-EF-1δ(F)的信号强度显著增强，但通过SE-UL13-K176M与HA-UL55的共表达则未增强，无论是否经过MG132处理。值得注意的是，MG132处理导致HA-UL55的信号强度显著增加。这些结果表明UL55和Us10可以增强UL13磷酸化EF-1δ Ser-133的能力。此外，我们的发现证明UL55在COS-7细胞中单独表达时本质上不稳定，可能由于其对蛋白酶体介导降解的敏感性。据报道，UL13对EF-1δ的磷酸化和UL13的自磷酸化导致在免疫印迹中出现迁移较慢的EF-1δ和UL13形式。有趣的是，当SE-UL13和EGFP-EF-1δ(F)与HA-UL55共表达时，EGFP-EF-1δ(F)、SE-UL13和HA-UL55似乎发生了电泳迁移位移，但当SE-UL13和EGFP-EF-1δ(F)在没有HA-UL55的情况下表达时则未出现。这一观察不仅表明UL55激活UL13，而且提出了UL13磷酸化UL55的有趣可能性。

为了检验Us10或UL55是否可以在体外激活UL13激酶活性，将人胚胎肾293T（HEK293T）细胞转染表达SE-UL13或其激酶失活突变体SE-UL13-K176M的质粒，结合表达与EGFP融合的Us10（Us10-EGFP）、与EGFP融合的UL55（UL55-EGFP）或EGFP的质粒。收获转染的细胞，溶解，并使用Strep-Tactin Sepharose珠进行下拉。将沉淀物在激酶缓冲液中与纯化的麦芽糖结合蛋白（MBP）与包含Ser-133的EF-1δ结构域融合{MBP-EF-1δ(107–146)}或其突变版本MBP-EF-1δ(107–146)-S133A（其中MBP-EF-1δ(107–146)中的Ser-133被丙氨酸取代）孵育，然后使用抗EF-1δ-S133

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抗体进行免疫印迹分析。

如图所示，Us10-EGFP与SE-UL13和SE-UL13-K176M共同沉淀。当SE-UL13与Us10-EGFP共表达时，检测到在Ser-133处磷酸化的MBP-EF-1δ(107–146)的信号，但未检测到S133A突变体的信号。当SE-UL13-K176M与Us10-EGFP共表达或当SE-UL13与EGFP共表达时，未检测到在Ser-133处磷酸化的MBP-EF-1δ(107–146)的信号。UL55-EGFP与SE-UL13和SE-UL13-K176M共同沉淀，尽管与SE-UL13-K176M共同沉淀的UL55-EGFP信号强度几乎检测不到，与SE-UL13相比。当SE-UL13与UL55-EGFP共表达时，检测到在Ser-133处磷酸化的MBP-EF-1δ(107–146)的信号，但未检测到S133A突变体的信号。相反，当SE-UL13-K176M与Us10-EGFP共表达或当SE-UL13与EGFP共表达时，未检测到在Ser-133处磷酸化的MBP-EF-1δ(107–146)的信号。这些结果表明Us10和UL55都可以增强UL13的激酶活性，并作为激活UL13的病毒辅因子，从而能够有效磷酸化特定底物如EF-1δ。值得注意的是，虽然与Us10-EGFP共表达的SE-UL13在免疫印迹中作为单一条带被检测到，但与UL55-EGFP共表达的SE-UL13被检测为两条具有不同迁移率的条带：一条似乎对应于与Us10-EGFP观察到的条带，另一条表现出较慢的迁移率。UL13的迁移较慢的条带先前据报道是自磷酸化的结果，支持我们关于UL55激活UL13的结论。此外，与UL55-EGFP共表达的SE-UL13的信号强度似乎高于与UL55-EGFP共表达的SE-UL13-K176M或与EGFP共表达的SE-UL13。我们还注意到，在转染细胞的共同沉淀实验中，可用数据不足以证明UL13与UL55和/或Us10特异性形成复合物。

重组病毒的构建和表征

为了研究UL55和/或Us10对HSV-2感染细胞中UL13的影响，我们构建了一系列重组病毒，包括：表达HA标签UL13（UL13-HA）的重组病毒YK873（UL13-HA）；UL55缺失突变病毒YK874（ΔUL55）；Us10缺失突变病毒YK876（ΔUs10）；和UL55/Us10双缺失突变病毒YK878（ΔUL55/ΔUs10）。整个UL55 ORF在YK874（ΔUL55）和YK878（ΔUL55/ΔUs10）中被删除。由于Us10的氨基末端结构域与Us11的羧基末端结构域重叠，在YK876（ΔUs10）和YK878（ΔUL55/ΔUs10）中，Us10中第14位的酪氨酸残基被替换为终止密码子。这种终止密码子替换设计为不影响Us11的氨基酸序列。Us10中第14位酪氨酸残基下游的第一个甲硫氨酸位于第168位。此外，我们生成了每个这些缺失突变被修复的重组病毒：YK875（ΔUL55-repair）、YK877（ΔUs10-repair）和YK879（ΔUL55/ΔUs10-repair）。

重组病毒的特征如下：（i）在感染YK873（UL13-HA）的猿肾上皮Vero细胞裂解液中，通过免疫印迹检测到UL13-HA的信号，但在感染野生型HSV-2 186的细胞中未检测到。（ii）感染野生型HSV-2 186或YK875（ΔUL55-repair）的Vero细胞显示UL55信号，而感染YK874（ΔUL55）的细胞则否，确认YK874（ΔUL55）中UL55基因被成功破坏。（iii）感染野生型HSV-2 186、YK874（ΔUL55）或YK875（ΔUL55-repair）的Vero细胞显示可比的UL56和由UL54基因编码的ICP27的信号强度，表明UL55缺失突变对其邻近基因的表达影响很小。值得注意的是，YK874（ΔUL55）感染细胞中的UL56在免疫印迹中主要作为单一条带被检测到，而野生型HSV-2 186或YK875（ΔUL55-repair）感染细胞中的UL56被检测为两条具有不同迁移率的条带，表明UL55在HSV-2感染细胞中对UL56的有效翻译后修饰是必需的。（iv）感染野生型HSV-2 186或YK877（ΔUs10-repair）的Vero细胞显示Us10信号，而感染YK876（ΔUs10）的细胞则否，确认YK876（ΔUs10）中Us10基因被成功破坏。（v）感染野生型HSV-2 186、YK876（ΔUs10）或YK877（ΔUs10-repair）的Vero细胞显示可比的Us9和Us11信号强度，表明YK876（ΔUs10）中的缺失突变对其邻近基因的表达影响很小。（vi）感染野生型HSV-2 186或YK879（ΔUL55/ΔUs10-repair）的Vero细胞显示UL55和Us10的信号，而感染YK878（ΔUL55/ΔUs10）的细胞则否，确认YK878（ΔUL55/ΔUs10）中两个基因都被成功破坏。（vii）感染野生型HSV-2 186、YK878（ΔUL55/ΔUs10）或YK879（ΔUL55/ΔUs10-repair）的Vero细胞显示可比的ICP27、UL56、Us9和Us11信号强度，表明YK878（ΔUL55/ΔUs10）中的缺失突变对UL55和Us10位点邻近基因的表达影响很小。在这些和后续实验中，UL37被用作对照，以确保感染具有可比性。

UL13与UL55和Us10在HSV-2感染细胞中的关联

为了研究UL13在HSV-2感染细胞中是否与UL55或Us10相互作用，将Vero细胞感染野生型HSV-2 186或YK873（UL13-HA），裂解，并使用抗HA抗体进行免疫沉淀。然后对免疫沉淀物进行免疫印迹分析。如图所示，抗HA抗体从YK873（UL13-HA）感染细胞的裂解液中与UL13-HA共同沉淀UL55和Us10，但未共同沉淀衣壳蛋白VP23。在野生型HSV-2 186感染细胞的裂解液中未观察到这种共同沉淀。这些结果表明UL13在HSV-2感染细胞中与UL55和Us10相互作用，并与我们上述发现一致，即当UL55和Us10分别与UL13共表达时，它们与UL13共同沉淀。

UL13对HSV-2感染细胞中UL55和Us10积累的影响

为了检验UL13对HSV-2感染细胞中UL55和Us10的影响，将Vero细胞模拟感染或感染野生型HSV-2 186、UL13缺失突变病毒YK862（ΔUL13）、其修复病毒YK863（ΔUL13-repair）、YK864（UL13-K176M）（编码酶失活UL13突变体）或其修复病毒YK865（UL13-K176M-repair），裂解并进行免疫印迹。如图所示，在感染YK862（ΔUL13）的细胞中，UL55和Us10信号几乎检测不到，尽管它们在感染野生型HSV-2 186或YK863（ΔUL13-repair）的细胞中积累。类似地，在感染YK864（UL13-K176M）的细胞中，Us10信号几乎检测不到，尽管它们在感染野生型HSV-2 186或YK865（UL13-K176M-repair）的细胞中积累。相反，感染YK864（UL13-K176M）的细胞中UL55的信号强度与感染野生型HSV-2 186或YK865（UL13-K176M-repair）的细胞相当。如先前报道和下文图8A所示，UL13中的K176M突变不会降低HSV-2感染Vero细胞中UL13的信号强度。这些结果表明UL13的存在，而非其激酶活性，是HSV-2感染细胞中UL55有效积累所必需的，而UL13激酶活性是Us10有效积累所必需的。类似地，据报道马立克氏病疱疹病毒的CHPK在感染细胞中稳定Us10。

UL55和/或Us10对HSV-2感染细胞中UL13介导的底物磷酸化的影响

为了检验UL55和/或Us10对HSV-2感染细胞中UL13底物的影响，将Vero或人骨肉瘤U2OS细胞模拟感染或感染野生型HSV-2 186、YK874（ΔUL55）、YK875（ΔUL55-repair）、YK876（ΔUs10）、YK877（ΔUs10-repair）、YK878（ΔUL55/ΔUs10）、YK879（ΔUL55/ΔUs10-repair）或YK864（UL13-K176M），裂解并进行免疫印迹。

先前的研究报道，野生型HSV-2感染增强EF-1δ Ser-133的磷酸化，通过抗EF-1δ-S133

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单克隆抗体检测，并导致EF-1δ的超磷酸化形式积累，通过抗EF-1δ多克隆抗体免疫印迹检测为迁移较慢的条带，与模拟感染相比。相反，感染YK864（UL13-K176M）时未观察到这些变化。EF-1δ超磷酸化形式的增加是由于EF-1δ在Ser-133的磷酸化，表明HSV-2感染细胞中该位点EF-1δ磷酸化的增强依赖于UL13。如图所示，感染YK874（ΔUL55）的Vero细胞中，在Ser-133处磷酸化的EF-1δ信号强度和EF-1δ的超磷酸化形式与感染野生型HSV-2 186或YK875（ΔUL55-repair）的细胞相比显著降低。相反，感染YK876（ΔUs10）的细胞中，在Ser-133处磷酸化的EF-1δ信号强度和超磷酸化EF-1δ与感染野生型HSV-2 186或YK877（ΔUs10-repair）的细胞相当。感染YK878（ΔUL55/ΔUs10）的Vero细胞表现出与YK874（ΔUL55）感染细胞相似的磷酸化谱，尽管在Ser-133处磷酸化的EF-1δ信号强度和EF-1δ的超磷酸化形式似乎进一步降低。实际上，感染YK878（ΔUL55/ΔUs10）的细胞中这些信号强度显著低于感染YK874（ΔUL55）的细胞，并且与感染YK864（UL13-K176M）的细胞观察到的相当。在U2OS细胞中也获得了类似的结果；然而，虽然YK878（ΔUL55/ΔUs10）和YK864（UL13-K176M）感染细胞之间超磷酸化EF-1δ信号强度的差异在Vero细胞中同样较小，但仅在U2OS细胞中具有统计学显著性。这些结果表明UL55和Us10都是HSV-2感染细胞中UL13诱导EF-1δ Ser-133磷酸化的最佳活性所必需的。

先前的研究报道，自磷酸化的UL13在免疫印迹中使用抗UL13单克隆抗体检测为迁移较慢的条带。如先前所示，感染野生型HSV-2 186或每个修复病毒的Vero细胞中的UL13被检测为两条具有不同迁移率的条带。相反，在感染YK864（UL13-K176M）的细胞中，对应于自磷酸化UL13的迁移较慢条带的信号几乎检测不到。类似地，在感染YK874（ΔUL55）或YK878（ΔUL55/ΔUs10）的细胞中，自磷酸化UL13的信号几乎检测不到。感染YK874（ΔUL55）的细胞中自磷酸化UL13信号与总UL13信号的比率与感染YK878（ΔUL55/ΔUs10）和YK864（UL13-K176M）的细胞相当。相反，感染YK876（ΔUs10）的细胞表现出与野生型HSV-2 186感染细胞相似的磷酸化谱，并且自磷酸化UL13信号与总UL13信号的比率与野生型HSV-2 186感染细胞相当。在U2OS细胞中也获得了类似的结果。这些结果表明UL55，而非Us10，是HSV-2感染细胞中UL13自磷酸化活性最佳所必需的，并且与我们上述发现一致，即自磷酸化UL13仅在UL55存在下检测到，而非Us10，在体外激酶实验中。

UL55和/或Us10对HSV-2复制和细胞间传播的影响

据报道，UL13的激酶活性以感染复数（MOI）和/或细胞类型依赖的方式，对有效的HSV-2复制和细胞间传播是必需的。为了检验UL55和/或Us10对细胞培养中HSV-2复制和细胞间传播的影响，我们分析了在U2OS和Vero细胞中感染野生型HSV-2 186、YK864（UL13-K176M）、YK865（UL13-K176M-repair）、YK874（ΔUL55）、YK875（ΔUL55-repair）、YK876（ΔUs10）、YK877（ΔUs10-repair）、YK878（ΔUL55/ΔUs10）或YK879（ΔUL55/ΔUs10-repair）的子代病毒产量和噬斑大小。如先前报道，YK864（UL13-K176M）的子代病毒产量在MOI为0.01的U2OS细胞中显著低于野生型HSV-2 186或YK865（UL13-K176M-repair），但在MOI为3时则不然。在MOI为0.01或3的Vero细胞中未观察到病毒产量的显著差异。此外，YK864（UL13-K176M）在U2OS细胞中形成的噬斑显著小于野生型HSV-2 186或YK865（UL13-K176M-repair），但在Vero细胞中则不然。类似地，YK874（ΔUL55）在MOI为0.01的U2OS细胞中表现出显著降低的子代病毒产量，与YK864（UL13-K176M）相当，并且显著低于野生型HSV-2 186和YK875（ΔUL55-repair）。然而，在MOI为3的U2OS细胞中未观察到这种降低，在MOI为0.01或3的Vero细胞中也未观察到。YK874（ΔUL55）在U2OS细胞中也产生显著较小的噬斑，再次与YK864（UL13-K176M）形成的相当，小于野生型HSV-2 186或YK875（ΔUL55-repair）形成的噬斑，而这些病毒株的噬斑大小在Vero细胞中相当。相反，YK876（ΔUs10）在U2OS和Vero细胞中显示的子代病毒产量和噬斑大小与野生型HSV-2 186和YK877（ΔUs10-repair）相当。YK878（ΔUL55/ΔUs10）的子代病毒产量和噬斑大小与YK874（ΔUL55）相似，表明在测试条件下，除UL55外删除Us10不会进一步损害病毒复制和细胞间传播。这些结果表明UL55，而非Us10，是细胞培养中有效HSV-2复制和细胞间传播所必需的，程度与UL13激酶活性相当。

VZV同源物UL55和Us10对VZV ORF47介导的EF-1δ磷酸化的影响

HSV-2 UL55和Us10在α疱疹病毒亚科中保守，但在β和γ疱疹病毒亚科中不保守。为了研究HSV-2 UL55和Us10对UL13的影响是否在其他α疱疹病毒中保守，我们检验了VZV UL55和Us10的同源物ORF3和ORF64是否对VZV ORF47（HSV-2 UL13的同源物）介导的EF-1δ磷酸化产生类似影响。将COS-7细胞转染表达EGFP-EF-1δ(F)的质粒，连同表达SE-ORF47或SE-ORF47-K157M（ORF47的激酶失活突变体）的质粒，结合表达HA标签的ORF3（HA-ORF3）或HA