Neddylation（类泛素化修饰）增强HIV前病毒转录与病毒颗粒感染性

本研究发现抑制neddylation（类泛素化修饰）可通过阻断CRL（Cullin-RING连接酶）介导的蛋白降解通路，显著降低多种潜伏逆转剂（LRA）激活的HIV前病毒转录水平，并增强病毒颗粒中A3G（APOBEC3G）的包装，从而降低病毒 infectivity（感染性）。研究揭示了neddylation在HIV潜伏激活和病毒传播中的关键作用，为开发新型HIV治疗策略提供了重要靶点。

　　

ABSTRACT

HIV潜伏库的存在是治愈艾滋病的主要障碍。本研究探讨了neddylation（一种类泛素化修饰）在HIV前病毒转录和病毒颗粒感染性中的调控作用。通过使用neddylation激活酶抑制剂MLN4924（MLN），研究发现抑制neddylation可显著降低多种潜伏逆转剂（LRA）（包括TNFα、PMA与离子霉素（PMAi）以及JQ1）激活的HIV转录水平，并降低病毒颗粒的感染性。

INTRODUCTION

目前，抗逆转录病毒疗法（ART）可有效抑制HIV复制，但无法清除潜伏的前病毒。一旦停止治疗，潜伏的前病毒可重新激活，导致病毒反弹。本研究旨在探讨neddylation是否通过激活Cullin-RING连接酶（CRL）来调节HIV转录和感染性。Neddylation通过将Nedd8蛋白连接到Cullin蛋白上，激活CRL，进而介导多种调控蛋白的泛素化和蛋白酶体降解。

RESULTS

抑制neddylation降低LRA处理后HIV在前病毒宿主细胞中的表达

在ACH2和J-Lat细胞系中，MLN处理显著降低了TNFα、PMAi和JQ1诱导的HIV p24蛋白表达和GFP报告基因表达。Western blot分析证实，MLN有效抑制了CUL2的neddylation，且浓度为200 nM时效果最佳。流式细胞术显示，MLN使TNFα处理的ACH2细胞中p24阳性细胞比例从91%降至46%，J-Lat 6.3细胞中GFP阳性细胞比例从12%降至3%。类似趋势在PMAi和JQ1处理组中也得到验证。

抑制neddylation降低HIV gag RNA

RT-qPCR分析表明，MLN处理使TNFα、PMAi和JQ1诱导的HIV gag RNA表达分别降低了6倍、5倍和7倍。为排除病毒扩散对实验结果的影响，研究使用HIV蛋白酶抑制剂saquinavir（SQ）阻断病毒成熟。结果显示，即使在SQ存在下，MLN仍能显著降低TNFα诱导的gag RNA表达，表明MLN的作用不依赖于病毒扩散。

抑制neddylation通过降低转录起始减少HIV RNA

为区分转录起始和延伸的影响，研究检测了TAR（转录起始标志）和Long LTR（转录延伸标志）RNA水平。结果显示，MLN处理显著降低了TAR RNA水平，而对Long LTR RNA影响不大，表明MLN主要抑制转录起始而非延伸。这一现象在TNFα、PMAi和JQ1处理组中均得到证实。

Neddylation对IkBα抑制剂和LRA驱动的HIV转录的影响

研究探讨了MLN影响HIV转录的机制。NF-κB通路的关键抑制剂IkBα在磷酸化（p-IkBα）后会被CRL^β-TrCP泛素化并降解，从而释放NF-κB进入核内激活HIV转录。Western blot显示，MLN处理增加了p-IkBα的积累。使用IKK抑制剂BMS-345541（BMS）或NF-κB核转位抑制剂JSH-23（JSH）均可模拟MLN的效应，显著降低LRA诱导的HIV转录和病毒产生，且MLN与BMS联用未产生叠加效应，表明MLN通过抑制NF-κB通路发挥作用。

抑制neddylation在ART抑制的PLWH的CD4 T细胞中降低HIV多重剪接RNA

研究进一步在ART抑制的HIV感染者（PLWH）的原代CD4⁺ T细胞中验证了MLN的效应。通过TILDA（Tat/rev诱导限制性稀释 assay）检测PMAi诱导的多重剪接RNA（msRNA），发现MLN处理使三名捐赠者的msRNA水平分别降低了35%、67%和43%，表明抑制neddylation在原代细胞中同样有效。

抑制neddylation在ACH2细胞中保护APOBEC3G免于降解并降低LRA刺激的病毒颗粒的感染性

研究还发现，MLN处理增加了病毒颗粒中A3G的包装，从而降低了病毒颗粒的感染性。Western blot证实，MLN处理使A3G在病毒颗粒中的含量增加。感染性实验显示，MLN使TNFα、PMAi和JQ1诱导的病毒颗粒感染性分别降低了85%、59%和45%。

DISCUSSION

本研究首次全面阐述了neddylation在HIV潜伏激活和病毒传播中的双重作用。抑制neddylation不仅通过阻断NF-κB通路降低HIV转录，还通过增加A3G包装降低病毒颗粒感染性。这些发现为开发新型HIV治疗策略提供了理论基础。尽管MLN因其广谱作用可能不适合直接临床应用，但针对特定CRL或底物（如IkBα或A3G）的精准调控策略可能具有重要转化价值。未来研究可在动物模型中验证MLN在ART中断后控制病毒反弹的潜力，并探索更特异的neddylation抑制剂。

MATERIALS AND METHODS

研究使用ACH2、J-Lat和TZM-bl细胞系，以及ART抑制的PLWH的原代CD4⁺ T细胞。细胞用MLN（100或200 nM）预处理6小时后，再用TNFα、PMAi或JQ1刺激。通过流式细胞术、Western blot、RT-qPCR、ELISA和感染性实验评估HIV表达和病毒特性。统计学分析采用ANOVA和Tukey多重比较检验。