内源性逆转录病毒与外源性逆转录病毒整合子表现出的表观遗传特征差异

本综述系统探讨了逆转录病毒在宿主基因组整合后经历的表观遗传调控（DNA甲基化、组蛋白修饰）如何塑造其序列特征，为区分内源性（ERV）与外源性（XRV）逆转录病毒提供了关键的分子标志（如CpG O/E比率、CGC三核苷酸频率及H3K27ac/H3K4me3等活性组蛋白修饰基序），对理解病毒进化、宿主防御及疾病关联（如KoRV相关肿瘤）具有重要价值。

　　

ABSTRACT

逆转录病毒在整合入宿主基因组后，会像脊椎动物基因一样受到宿主的表观遗传调控。然而，不同属的逆转录病毒其整合模式不同，因此其可能受到的表观遗传调控也存在差异。β逆转录病毒和γ逆转录病毒是两类易于感染生殖细胞并发生内源化的简单逆转录病毒。虽然古老的内源性逆转录病毒（ERV）因突变失活而易于识别，但近期的整合子可能仍保留完整的病毒生产能力，这使得有时难以区分哪些整合子是外源性的且可能具有更重要的临床意义。由于内源性逆转录病毒通常以原病毒DNA形式整合时间更长，并受到宿主表观遗传调控，我们假设可以证明这些整合子与其外源性对应物存在序列差异，这些差异可能源于DNA甲基化和组蛋白修饰，并且内源性逆转录病毒通常会表现出对宿主启动子的适应。因此，我们利用公开序列数据进行了统计分析，证明内源性逆转录病毒变异体随时间推移表现出CpG二核苷酸频率的降低和三核苷酸频率的改变，并且会显示出与“活性”组蛋白修饰相关的基序丢失的证据。对这些模式的深入研究为区分内源性和外源性逆转录病毒变异体提供了进一步线索，可能有助于对特征较少的野生动物物种中逆转录病毒的研究。

INTRODUCTION

逆转录病毒是能够整合入宿主基因组的独特病毒家族。它们携带特有的聚合酶，能够将病毒RNA基因组逆转录为DNA，然后整合入宿主DNA，从而永久性地改变被感染细胞及其后代的基因组。当逆转录病毒感染生殖细胞时，它们可以融入后代个体的每一个细胞，这一过程称为内源化。内源化后，逆转录病毒倾向于在世代更迭中积累突变，导致其启动子序列和/或基因产物缺陷。因此，内源性逆转录病毒序列的突变程度可以窥见其在物种中内源化的时间长短。据报道，超过40%的哺乳动物基因组是逆转录的产物，包括长散在核元件（LINEs）和短散在核元件（SINEs），其中8%–10%源自内源性逆转录病毒。

逆转录病毒根据其基因组组织和结构分为七个主要属。这些属表现出对不同基因组区域整合的倾向性不同。例如，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）和猫免疫缺陷病毒（FIV）在内的慢病毒，倾向于整合到转录活跃的基因体内。另一方面，包括鼠白血病病毒（MuLV）和猫白血病病毒（FeLV）在内的γ逆转录病毒，倾向于靶向富含CpG的基因启动子。β逆转录病毒，如小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）和绵羊肺腺瘤病毒（JSRV），对转录起始位点（TSS）表现出较弱的倾向性，但通常似乎具有更随机的整合分布。与慢病毒相比，γ逆转录病毒和β逆转录病毒更容易感染生殖细胞并发生内源化，这体现在它们的内源性残余存在于每一个被检查的主要哺乳动物基因组中，包括人类中的人类内源性逆转录病毒-K（HERV-K，一种β逆转录病毒）和人类内源性逆转录病毒-W（HERV-W，一种γ逆转录病毒）。有趣的是，内源性的β和γ逆转录病毒通常可以有具有完全感染性和复制能力的外源性对应病毒。它们的序列通常只有轻微差异，通常是在长末端重复序列（LTR）和/或包膜（env）区域，分别影响其表达和嗜性。

对于一些物种，如MuLV和FeLV，其内源性和外源性逆转录病毒变异体已有很好的表征。然而，在特征较差的物种中，区分具有转录完整基因组的近期整合子可能很困难。一个典型的例子是考拉逆转录病毒KoRV，它是一种正处于内源化过程中的γ逆转录病毒。该病毒与白血病和淋巴瘤有关，也与衣原体等继发感染有关。迄今为止，已描述了10种不同的亚型，随地理分布而变化，并表现出与疾病的不同关联。KoRV-A似乎是该病毒产生的内源性变异体，而其他亚型表现出更明显的疾病关联，被认为是外源性的。

更令人困惑的是，内源性和外源性逆转录病毒会发生重组。FeLV的内源性变异体可以与外源性变异体FeLV-A重组，产生具有不同嗜性的新病毒，甚至可能与其他亲缘关系较远的内源性逆转录病毒类型发生重组事件，从而在属内产生多样性和进化。大多数这些重组事件发生在单一或密切相关的物种内的病毒之间，但也有来自更分化物种的γ逆转录病毒之间重组的例子。例如，在家猫中发现的另一种内源性γ逆转录病毒RD114，似乎是内源性猫逆转录病毒（Felis catus endogenous retrovirus, FcEV）和狒狒内源性逆转录病毒（BaEV）之间重组事件的产物，并被认为是由旧大陆猴向家猫的跨物种病毒传播所致。

已描述了多种用于抑制内源性逆转录病毒感染的表观遗传机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。外源性逆转录病毒也可能受到这些相同机制的调控，作为宿主抗病毒防御的分子武器，这使得它们成为HIV研究中的一个活跃领域。然而，与宿主物种共同进化的内源性逆转录病毒通常比其外源性对应物受到更严格的转录抑制，这促使我们假设表观遗传抑制的序列特异性证据通常在内源性变异体中更为明显。

先前有报道称，HIV以其低CpG含量反映了人类基因组，并有证据表明这主要是CpG甲基化后的脱氨作用而非其他可能机制（如APOBEC3或Toll样受体导致的CpG耗竭）的产物。由于它们倾向于整合到启动子区域，我们假设γ逆转录病毒会反映其各自物种启动子的CpG含量，并且我们最初也假设β逆转录病毒基因组的CpG含量可能由于TSS整合偏好而反映启动子的CpG含量。我们还假设内源性变异体会表现出相对于外源性变异体降低的CpG含量，表明内源化后发生了更多的CpG甲基化和脱氨作用，以及与其宿主物种甲基化模式一致的 altered CpG三核苷酸基序。最后，我们假设与外源性近端原病毒序列相比，与“活性”组蛋白修饰一致的基序会更明显，而与抑制性修饰（如H3K9me3）更一致的基序在已知的内源性序列中会更明显。为了检验这些假设，我们对各种逆转录病毒的CpG频率和CpG三核苷酸基序频率进行了统计分析，并比较了内源性与外源性变异体，以及它们与所在物种启动子序列的比较。我们还进行了亚硫酸氢盐作图以检查内源性逆转录病毒与启动子的甲基化模式。最后，我们使用MEME套件中的简单富集分析（SEA）工具检查了与组蛋白修饰相关的基序差异。由于β逆转录病毒具有与γ逆转录病毒不同的整合倾向，我们专注于我们在每个属中能够检查的少数病毒的特征，因为它们的整合行为可能影响其表观遗传调控。

RESULTS

近期内源化的β和γ逆转录病毒反映真兽类宿主启动子的CpG含量，其可变性可归因于DNA甲基化

为了评估β逆转录病毒和γ逆转录病毒如何适应其各自物种的基因组，我们使用基于Python的Kmer工具检查了来自猫、小鼠、猪、绵羊和考拉的完整内源性和外源性逆转录病毒的CpG含量。Kmer工具计算D比率，即基于一阶马尔可夫条件概率模型的观测值/预期值（或O/E比率）。我们评估了内源性逆转录病毒的CpG含量相对于所有五个物种中多个基因组区域（TSS上游500 bp、TSS上游1 kb、TSS上游2 kb、整个基因体、所有基因下游1 kb以及整个染色体）的情况。

在大多数情况下，ERV反映了TSS上游500 bp区域的CpG含量，特别是对于我们评估的γ逆转录病毒。我们评估的β逆转录病毒也呈现这种趋势，特别是enJSRV相对于我们检查的其他内源性逆转录病毒具有更高的CpG O/E比率。然而，这五种不同的哺乳动物物种在启动子区域（在图中定义为TSS上游1 kb）表现出彼此显著不同的CpG O/E比率，这表明虽然内源性β和γ逆转录病毒的平均CpG O/E比率约为0.5，但它们可能显著偏离启动子CpG含量，这取决于它们感染的物种。猫尤其在所有检查的区域中表现出整体更高的CpG含量，而绵羊、考拉和小鼠在TSS 1 kb范围内表现出较低的相关CpG含量，接近0.4。

基于我们的分析，我们比较了每个物种中内源性和外源性β和γ逆转录病毒的CpG含量与TSS上游500 bp区域的情况。小鼠和绵羊都显示其启动子的CpG含量与其各自的逆转录病毒存在显著差异，反映了它们整体较低的启动子CpG含量。然而，所检查的五个物种中有三个其逆转录病毒CpG含量与启动子之间没有显著差异。为了排除古老逆转录病毒序列存在于启动子中的潜在影响，我们还使用LTRHarvest去除所有LTR和反转录转座子样序列，并使用Kmer工具重新分析CpG含量，这对分析的启动子序列的CpG含量产生了最小改变。

当比较内源性与外源性逆转录病毒的CpG含量时，内源性γ逆转录病毒FeLV和MuLV与其外源性对应物相比，表现出统计学上显著的CpG含量降低。然而，所分析的β逆转录病毒（MMTV和JSRV）的差异不如现有序列那么明显。事实上，内源性与外源性MMTV未注意到显著差异，但MMTV的CpG含量分布高度偏斜，因为公开可用的全长复制子非常少（即enMMTV有5个，exMMTV有6个），使得难以得出确切的结论。然而，JSRV有更多的复制子可用，内源性JSRV有19个复制子，外源性JSRV有20个复制子。JSRV有两种外源性变异体，一种引起地方性鼻肿瘤病毒（ENTV），另一种引起绵羊肺腺瘤病（OPA）。只有JSRV的ENTV版本在内源性变异体相比CpG含量上存在显著差异，尽管我们自己对全长序列的系统发育分析表明它与内源性JSRV变异体的亲缘关系比外源性OPA变异体更近。

为了检查DNA甲基化在所有检查的逆转录病毒CpG含量中的作用，我们计算了CpG、TpG和CpA O/E比率之间的相关性，以评估甲基化胞嘧啶的脱氨作用。甲基化胞嘧啶的脱氨作用随时间发生，将CpG景观转变为TpG和互补链上的CpA，而非甲基化胞嘧啶不受这些相同力量的影响。引人注目的是，内源性和外源性JSRV都显示出强烈的显著对称负相关。外源性JSRV的相关性出乎意料地比内源性变异体中发现的更深刻。在所检查的具有密切相关的