卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）在核质网处进行初级包膜化的机制研究

本研究发现卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）在裂解复制过程中利用宿主细胞核质网（NR）结构进行核衣壳的初级包膜化，揭示了病毒通过募集磷脂酰胆碱合成酶（CCTα）促进核膜内陷形成I型NR（Type-I NR）的机制，并首次通过活细胞成像技术动态追踪了病毒基因组和衣壳在NR中的运输过程，为疱疹病毒核逸出（nuclear egress）提供了新的理论框架。

　　

核内陷结构在KSHV裂解复制过程中显著增加

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的裂解复制过程伴随着核膜结构的显著重塑。研究人员使用可诱导的iSLK-BAC16细胞模型，通过多西环素和丁酸钠处理激活病毒从潜伏期进入裂解期。实时定量PCR（RT-qPCR）分析显示，病毒立即早期基因（nRTA）、早期基因（ORF57）和晚期基因（ORF65）的转录水平随时间推移发生动态变化，其中ORF65表达在72小时达到峰值，标志着晚期复制阶段的开始。病毒基因组复制在48小时后急剧增加，感染性病毒颗粒的产生在72小时达到高峰。透射电子显微镜（TEM）分析揭示，在裂解复制过程中，核内陷（NI）的数量和复杂性显著增加。这些结构被分为一级、二级、三级内陷和卷曲膜结构，其中一级内陷是直接与内核膜（INM）相连的单层膜结构，二级内陷则包含多个膜层，形成更复杂的核质网（NR）网络。

KSHV在I型核质网处完成初级包膜化

核质网（NR）根据其膜结构特征分为I型和II型。I型NR是单层膜结构，由INM内陷形成，缺乏核纤层蛋白；II型NR则包含INM和外核膜（ONM）的双层膜结构，具有核孔复合体和核纤层。本研究通过TEM观察到KSHV的成熟衣壳（C-capsids）主要在一级内陷（即I型NR）中完成初级包膜化，而在II型NR中未观察到包膜化事件。I型NR结构通过管状“颈”与INM相连，其膜表面缺乏核纤层蛋白，这与I型NR的定义一致。此外，这些结构内充满了获得包膜的C-衣壳，表明I型NR是KSHV初级包膜化的主要场所。尽管II型NR在裂解复制过程中同样扩张，但病毒衣壳似乎通过某种特异性机制被靶向至I型NR进行包膜化。

核质网扩张与CTP:磷酸胆碱胞苷酰转移酶（CCTα）的募集相关

核质网的扩张需要新的膜生物合成和膜曲率变化。本研究通过免疫荧光显微镜发现，在KSHV裂解复制过程中，宿主酶CTP:磷酸胆碱胞苷酰转移酶（CCTα）被募集至核质网结构。CCTα是磷脂酰胆碱（PtdCho）合成途径中的限速酶，其激活后插入INM，催化膜生物生成所需的关键步骤。在潜伏期感染的细胞中，CCTα均匀分布在核质中，而在裂解期，CCTα形成明显的点状结构，与核纤层蛋白A/C（lamin A/C）部分共定位，表明其参与I型和II型NR的扩张。此外，内质网相关蛋白VAPA（vesicle-associated membrane protein-associated protein A）在II型NR中富集，进一步证实了NR结构的特异性。

C-衣壳选择性进入I型核质网进行包膜化

病毒衣壳的核逸出过程存在质量调控机制，只有成熟的、含有基因组的C-衣壳被选择性输出。本研究通过定量分析TEM图像发现，在裂解复制高峰期（72小时），约30%的核内衣壳与NR结构相关，其中绝大多数位于一级内陷。相比之下，未成熟的A-衣壳和B-衣壳主要分布在核质中，无法进入NR结构。此外，研究还观察到C-衣壳在二级内陷中的积累，提示这些复杂结构可能在衣壳运输中发挥作用。随着复制进程推进（96小时），大多数C-衣壳已运输至细胞质，NR结构逐渐空置，但仍保持其形态，表明这些结构在病毒复制后仍然存在。

动态标记病毒基因组揭示衣壳在核质网中的运输路径

为了实时追踪病毒衣壳在NR中的运输过程，研究人员采用CLICK化学标记技术。 newly合成的病毒DNA通过5-乙烯基-2'-脱氧尿苷（VdU）标记，并通过吖啶四嗪（PINK）探针进行荧光检测。在固定细胞实验中，CLICK标记的病毒基因组与ORF65（小衣壳蛋白）共定位，证实这些荧光点代表包装好的病毒衣壳。活细胞成像显示，DiOC₆标记的NR结构与病毒基因组富集区密切相关。实时观察发现，病毒衣壳从大型NR区室通过管状“颈”运输至核 periphery，最终进入细胞质，整个过程仅需数分钟。此外，表达荧光标记衣壳（ORF65_mScarlet）和包膜糖蛋白（gM_mNeon）的重组KSHV病毒进一步证实了衣壳在NR中的动态运输过程。

讨论

疱疹病毒的核逸出是一个多步骤过程，涉及衣壳在INM处的初级包膜化及其后续的包膜脱落。本研究首次系统性地证实了KSHV利用I型NR作为初级包膜化的 alternative场所，与经典的核 periphery包膜化途径并存。病毒通过募集CCTα促进膜生物合成，驱动I型NR的扩张，从而为衣壳包膜化提供更多膜表面。此外，研究还发现病毒衣壳特异性靶向I型NR的机制，尽管II型NR同样扩张，但衣壳无法在其上完成包膜化。活细胞成像技术的应用为病毒衣壳在NR中的动态运输提供了直观证据，为后续研究提供了重要技术框架。未来研究应聚焦于KSHV核逸出复合体（NEC）在NR包膜化过程中的作用，以及病毒如何调控宿主膜曲率机制以促进自身复制。