利用Sortase A可编程切割与连接功能构建合成蛋白质降解回路实现逻辑门控的靶向蛋白降解

研究人员为克服现有靶向蛋白降解（TPD）技术静态调控的局限，开发了基于Sortase A（SrtA）切割与连接双功能的LASER（Logic-gated AdPROM deploying SrtA-mediated Element Recombination）平台。该技术通过SrtA介导的元件重组实现了生物PROTAC（bioPROTAC）的可逆激活、多靶点切换及AND逻辑门控制，为哺乳动物细胞中动态调控内源蛋白水平提供了新工具，在疾病治疗与细胞功能研究领域具有重要应用价值。

　　

在细胞生命活动中，蛋白质的表达和活性动态调控着几乎所有生物学功能。传统研究多通过基因层面的干预（如RNA干扰或基因编辑）来探索蛋白质功能，但这些方法存在响应慢、不可逆或缺乏条件性调控等问题。近年来，靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）技术迅速发展，特别是利用细胞内天然泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）的蛋白降解嵌合体技术，为动态调控蛋白质水平提供了新思路。其中，生物PROTAC（bioPROTAC）作为一种异源双功能蛋白质，能同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶，诱导目标蛋白降解，在功能研究和疾病治疗方面展现出巨大潜力。

然而，现有TPD策略多为静态设计，缺乏可逆、多靶点切换和逻辑门控等高级功能，限制了其在复杂生物学环境中的应用。为此，研究人员在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究，开发了一种基于Sortase A（SrtA）酶可编程切割与连接功能的合成蛋白质降解回路——LASER系统，实现了对蛋白质降解的动态、逻辑门控式调控。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 使用增强型SrtA7+突变体实现高效细胞内切割与连接；2. 利用splitFAST荧光报告系统实时监测SrtA活性；3. 设计SrtA响应型AdPROM（Affinity-directed Protein Missile）构建体实现降解功能的可逆切换；4. 整合TEV蛋白酶（TEVp） cleavage motif实现AND逻辑门控制；5. 通过流式细胞术和Western blot验证降解效果及蛋白表达。

研究结果

Demonstrate effective SrtA-mediated bioconjugation in human cells via a splitFAST fluorescent reporter system

通过改造的splitFAST荧光报告系统，研究人员首先在HeLa细胞中验证了SrtA7+突变体的切割和连接活性。当SrtA7+存在时，splitFAST_SrtA片段成功连接并恢复荧光；而在全长FAST_SrtA中，SrtA7+介导的切割使荧光信号显著降低，证实了SrtA在细胞内的双向酶活功能。

Sortase A as a bioPROTAC control switch for targeted protein degradation

研究人员设计了SrtA响应型AdPROM_SrtA构建体，分别实现降解功能的“关闭”和“开启”控制。在“关闭”设计中，插入LPETGG motif的AdPROM_SrtA可在SrtA7+作用下切割失活，恢复目标蛋白（如SH2-GFP）表达；在“开启”设计中，分裂表达的VHL-LPETGG和GGG-aGFP需在SrtA7+介导下连接形成完整AdPROM，才能启动降解。实验表明，当GGG-aGFP与VHL-LPETGG转染比例高于5:1时，才能有效降解SH2-GFP。

Sortase A-mediated intracellular retargeting for conditional targeted protein degradation

SrtA的双功能特性允许在同一细胞内切换降解靶标。研究人员通过共表达全长靶向YFP的AdPROM_SrtA和GGG-aSH2，在SrtA7+存在下，将降解目标从YFP切换至SH2-miRFP670，实现了动态重定向降解。

Expanding Sortase A ligation with logic functions

为增强调控复杂性，研究人员进一步整合了TEV蛋白酶响应机制。通过在GGG-aSH2前添加TEVp cleavage motif（ENLYFQ|G）和屏蔽蛋白Electra2，创建了AND逻辑门设计：仅当TEVp和SrtA7+同时存在时，才能暴露 triglycine motif并完成连接，激活降解。

Logic-gated targeted protein degradation via protease-masked Sortase A ligation

最终构建的LASER平台实现了三种可切换状态：1. 仅TEVp表达时，降解YFP；2. 仅SrtA7+表达时，降解功能关闭；3. 两者共存时，降解目标切换至SH2-miRFP670。Western blot验证了切割与连接反应的特异性，时间动力学实验表明切换可在转染后16小时内完成。

结论与意义

该研究通过巧妙利用SrtA酶的切割与连接双功能，创建了可动态调控靶向蛋白降解的LASER平台，突破了现有TPD技术的静态限制。该系统不仅支持降解功能的可逆切换和多靶标重定向，还能通过蛋白酶门控机制实现AND逻辑操作，为精确调控细胞内蛋白网络提供了强大工具。该技术有望应用于疾病治疗、诊断试剂开发以及合成生物学领域的复杂电路设计，特别是在研究必需基因功能、动态蛋白互作等方面具有独特优势。未来通过整合光遗传学或小分子控制的split蛋白酶系统，可进一步扩展其输入响应范围和临床应用潜力。