二硫键约束刚性Fab抗体片段突破冷冻电镜靶点尺寸限制实现小蛋白高分辨率结构解析

本研究针对冷冻电镜（cryoEM）难以解析小蛋白（<50 kDa）结构的难题，通过工程化设计引入策略性二硫键，将抗体片段（Fabs）转化为构象刚性Fabs（Rigid Fabs）。该设计成功获得Ang2（26 kDa）和KRAS（21 kDa）的2.3–2.5 ?高分辨率结构，为小蛋白结构解析提供了通用解决方案。

　　

在结构生物学领域，高分辨率蛋白质结构对于理解生物机制和药物发现至关重要。冷冻电镜（cryoEM）革命性地改变了大型蛋白质复合物的结构解析方式，然而大多数疾病相关蛋白分子量较小（低于50 kDa），由于信噪比低和比对困难，难以获得高分辨率结构。现有策略如使用支架蛋白虽能增大靶点尺寸，却因固有柔性导致靶点分辨率远低于支架本身，成为技术瓶颈。

发表于《Nature Communications》的一项研究通过迭代工程化分子设计，将抗体片段（Fabs）转化为构象刚性Fabs（Rigid Fabs），成功实现了小至约20 kDa蛋白质的高分辨率结构解析。该团队通过引入策略性二硫键，创建了折叠良好、刚性约束的Fabs，适用于不同物种、框架和嵌合构建体。利用刚性Fabs，研究人员解析了Ang2（26 kDa）和KRAS（21 kDa）的2.3–2.5 ?冷冻电镜结构，突破了单颗粒冷冻电镜的靶点尺寸限制。

研究采用多项关键技术方法，包括：基于结构引导的蛋白质工程设计二硫键；哺乳动物细胞（CHO）表达系统制备Fab变异体；生物层干涉技术（BLI）验证结合亲和力；X射线晶体学验证二硫键形成；冷冻电镜单颗粒分析（使用Titan Krios显微镜结合K3/Gatan探测器）进行高分辨率数据收集；局部重构和聚焦细化处理柔性区域；分子置换和迭代模型构建完成结构解析。样本包括人源化、鼠源及嵌合Fab，以及多种靶蛋白复合物。

Design, iteration and characterization of Rigid Fabs

研究人员通过分析Fab晶体结构，发现可变域与恒定域之间的肘部角度（115–225°）存在高度可变性，导致冷冻电镜图中Fab恒定域分辨率较差。以往试图缩短和突变Herceptin Fab重链肘部的尝试未能彻底解决柔性問題。本研究通过结构比对发现兔源Fab因轻链肘部C80–C171二硫键而天然更刚性，进而设计在人类Fab中引入相应突变（如P80C:S171C）。此外，还鉴定了其他保守残基对（如LC中的E81:S168、F83:Q166、I106:S171和HC中的L11:P151、T110:P151），使其Cβ–Cβ距离≤5.5 ?，可通过半胱氨酸突变形成二硫键。以β-类胰蛋白酶（120 kDa）和E104.v1 Fab（与类胰蛋白酶形成4:4复合物，320 kDa）为模型系统，测试了野生型（WT）、2DS（引入两个二硫键）和4DS（引入四个二硫键）Fab变体。所有变体表达水平与WT相当，结合亲和力相同。冷冻电镜分析表明，2DS Fab比WT更刚性，但恒定域仍有柔性；4DS Fab通过额外二硫键（如LC中P40C:E165C和HC中L108C与插入半胱氨酸）显著增强刚性，整体分辨率达2.5 ?，局部分辨率均匀。为进一步减少恒定域柔性，还设计了5DS和6DS变体（引入恒定域链间二硫键，如F116C_LC:A141C_HC），使6DS Fab整体分辨率提升至2.4 ?。

Rigid Fab designs increase rigidity of non-human and chimeric Fabs

为验证设计的普适性，研究人员将4DS设计应用于鼠源Fab 7A9（靶向NavAb-Nav1.7通道）和嵌合Fab Rituximab（RTX，靶向CD20）。冷冻电镜结构显示，7A9.4DS和RTX.4DS的恒定域分辨率显著高于WT，证实4DS突变能有效刚性化非人源和嵌合Fab。对于CD20-RTX.4DS复合物，Fab刚性增加导致CD20跨膜螺旋远端分辨率降低，但通过局部细化可改善这一问题。

Rigid Fabs enable high-resolution structures of small proteins

研究团队应用刚性Fabs解析了两个小蛋白的高分辨率结构。对于Ang2（26 kDa），使用5A12.6DS Fab（与ProA-ProG融合蛋白形成三元复合物）获得2.7 ?整体分辨率结构，局部分辨率达2.3 ?，密度图清晰显示侧链和水分子。与WT Fab相比，6DS样本用更少颗粒数达到更高分辨率（3.3 ? vs. 3.7 ?）。对于KRAS^G12C（21 kDa），使用2H11.4DS Fab（针对λ轻链调整突变位点，如K166C）解析了其与共价抑制剂GNE-1952复合物的2.8 ?结构，局部细化后分辨率达2.7 ?，清晰显示配体结合位点。

结论与意义

该研究开发的二硫键约束刚性Fab策略成功克服了冷冻电镜小蛋白结构解析的尺寸限制，通过模块化设计实现跨物种、框架和嵌合Fab的普适性应用。刚性Fabs不仅显著提高图像对齐精度和分辨率，还支持水分子和配体等精细特征的解析，为小蛋白（包括药物靶点）的高分辨率结构研究提供了强大工具。这一技术有望加速基础研究中的分子机制探索和药物设计进程，使冷冻电镜技术惠及更广泛的蛋白质组。