心磷脂动态调控线粒体OPA1介导的膜重塑机制——揭示Barth综合征的分子基础

本研究针对心磷脂(CL)调控线粒体形态的精确机制问题，通过分子动力学模拟和冷冻电镜技术，揭示了线粒体融合蛋白OPA1通过其桨叶结构域中两个保守基序（MIL和docking region）特异性结合CL的分子机制。研究人员开发了溴标记心磷脂(CL-Br)探针增强冷冻电镜对比度，首次直接观察到CL在OPA1结合叶片的富集现象，并发现Barth综合征相关的单溶血心磷脂(MLCL)积累会改变膜机械性能，显著抑制OPA1的膜重塑功能。该研究为理解线粒体膜动态调控提供了分子见解，为Barth综合征的治疗策略指明了新方向。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其动态的网络结构和功能完整性对细胞存活至关重要。这些双膜结构的细胞器通过持续的分裂和融合过程维持其形态，其中内膜的融合主要由OPA1蛋白调控。心磷脂(CL)是线粒体内膜特有的磷脂成分，占脂质含量的20%，以其独特的双甘油磷酸骨架和四条脂肪酸链结构而著称。研究表明CL与多种线粒体蛋白相互作用，但如何精确调控线粒体形态的具体机制仍不明确。Barth综合征作为一种X连锁遗传病，由于tafazzin(TAZ)基因突变导致CL代谢异常，单溶血心磷脂(MLCL)积累，患者出现心肌病、骨骼肌病变和中性粒细胞减少等症状，但MLCL积累如何影响蛋白质功能的分子机制尚未阐明。

本研究发表于《Nature Communications》，团队通过整合计算模拟、生物化学实验和结构生物学方法，揭示了CL通过动态相互作用调控OPA1介导的膜重塑机制。研究人员主要采用分子动力学模拟（包括粗粒化和全原子模拟）、冷冻电镜结构解析（使用溴标记心磷脂增强对比度）、脂质体共沉降实验和负染透射电镜等技术方法，其中蛋白样本来源于重组表达的人源S-OPA1，脂质体采用模拟线粒体内膜组成的配方（POPC/POPE/CL）。

Microsecond CG MD simulations reveal OPA1 membrane binding sites

通过从S-OPA1聚合物中提取四种不同的四聚体亚组装进行微秒级粗粒化分子动力学模拟，发现所有四聚体均能与膜结合。高度保守的膜插入环(MIL)区域（771WKKRWLYWKNR781）插入脂双层，而第二个保守位点docking region（857RRGFY861）与膜发生外周相互作用。突变这些关键位点会消除膜结合活性。

CL molecules cluster at OPA1 membrane binding sites in simulations

模拟显示CL分子在蛋白-膜接触位点快速聚集，尽管膜中浓度仅20%，但CL却占蛋白-膜接触的50%。CL与蛋白的接触停留时间比其它磷脂长5-10倍，表明CL与OPA1的相互作用具有特异性。

AA MD simulations confirm local CL accumulation near protein contact sites

全原子模拟进一步验证了CL在MIL和docking region周围的局部富集。MIL中的色氨酸残基嵌入膜疏水核心，与脂质尾部发生疏水相互作用，而带正电荷的残基则与CL的带负电头基形成静电相互作用。

S-OPA1 tetramer is capable of bending membranes

CG模拟显示S-OPA1四聚体能够诱导膜弯曲，形成正曲率（凸向蛋白），局部曲率半径达20-50nm，与实验观察的OPA1管状结构一致。CL和POPS膜都能被弯曲，但POPS膜的变形程度较弱。

Saturation of CL acyl chains hinders S-OPA1 activity

体外重构实验表明，饱和CL物种（CL(16:0)₄和CL(18:0)₄）显著降低S-OPA1的膜结合和重塑活性，而不饱和物种（特别是CL(18:2)₄）支持最强的膜重塑功能，说明CL酰基链组成对OPA1功能至关重要。

The two CL binding motifs contribute to the membrane remodeling activity of S-OPA1

构建R858A、MIL多丙氨酸突变和双突变体，发现这些突变显著降低膜结合和重塑活性。R858A突变使重塑面积减少80%，而MIL突变则完全消除重塑功能，证实这两个保守基序对OPA1功能的关键作用。

Structure of S-OPA1 assembly bound to membranes containing contrast-enhancing probes

使用溴标记心磷脂(CL-Br)增强冷冻电镜对比度，解析了S-OPA1与含CL-Br膜结合的结构，分辨率达6.4?。结构显示S-OPA1形成螺旋状同源多聚体 filaments，外径48.4nm，内腔直径19.1nm。

CryoEM structure shows CL enrichment in the OPA1-bound outer leaflet

通过比较未标记和溴标记膜的库仑势，发现CL在OPA1结合叶片的外叶富集，特别是在MIL和docking region周围，实验验证了CL在蛋白-膜接触位点的动态聚集。

MLCL forms similar clusters near protein-membrane contact sites

尽管MLCL与OPA1的相互作用模式和停留时间与CL相似，但MLCL积累显著减弱膜变形能力，说明MLCL改变了膜的机械性能而非直接相互作用。

MLCL accumulation impairs OPA1's ability to bend and remodel membranes

共沉降实验显示MLCL替代仅轻微影响膜结合，但重构实验表明MLCL积累使膜重塑面积减少90%以上，即使低浓度MLCL（1-5%）也显著抑制OPA1聚合和膜重塑功能。

研究结论表明，CL通过动态聚集在OPA1的膜结合位点，促进膜变形和蛋白寡聚化，从而调控线粒体内膜重塑。MLCL积累通过改变膜机械性能而非直接蛋白相互作用抑制OPA1功能，这为Barth综合征的分子机制提供了直接解释。该研究不仅阐明了CL调控线粒体形态的精确机制，还开发了溴标记脂质探针这一通用工具，为研究其他膜相关过程提供了新方法，对理解线粒体相关疾病的病理机制和开发治疗策略具有重要意义。