OCT4转录因子通过其内在无序区编码的短线性肽SLiPERs实现细胞类型特异性功能调控

本研究揭示了转录因子OCT4通过其内在无序区（IDRs）中特异的短线性肽（SLiPERs）实现细胞重编程功能的新机制。研究人员发现SLiPERs在诱导多能干细胞（iPSCs）和滋养层干细胞（iTSCs）的重编程过程中不可或缺，但在胚胎干细胞（ESCs）自我更新中却可被替代。这些肽段通过招募TNIP2等特异性蛋白伴侣，调控染色质开放性和基因表达，为理解转录因子功能特异性提供了新视角。

　　

转录因子在细胞命运决定中扮演着关键角色，但一个令人困惑的问题是：同一个转录因子如何在不同细胞类型中发挥特异性功能？OCT4（又称POU5F1）就是这样一个多面手——它既能维持胚胎干细胞的自我更新，又能诱导体细胞重编程为多能干细胞，甚至还能促进向滋养层干细胞等谱系的分化。这种功能多样性背后的分子机制一直是个未解之谜。

近日发表在《Nature Communications》的一项研究揭开了这个谜团的关键部分。研究人员发现OCT4的内在无序区（IDRs）中隐藏着一些短线性肽段，它们像分子开关一样控制着OCT4在不同细胞环境中的特异性功能。这些被命名为SLiPERs（Short Linear Peptides Essential for Reprogramming）的肽段对重编程过程至关重要，却在干细胞自我更新中显得无关紧要。

为了深入探索OCT4的功能模块，研究团队构建了119个OCT4缺失突变体，系统性地扫描了整个蛋白质的功能区域。通过在鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中进行重编程实验，他们发现删除某些IDR区域会显著降低iPSC的形成效率，而这些区域正是SLiPERs所在的位置。有趣的是，这些对重编程至关重要的区域在维持胚胎干细胞自我更新时却可以被其他区域替代。

研究进一步揭示了SLiPERs在不同物种中的保守性。在人类成纤维细胞重编程实验中，SLiPER突变体同样表现出重编程缺陷，而删除其他非SLiPER区域甚至能增强重编程效率。更令人惊讶的是，当研究团队测试OCT4在诱导滋养层干细胞（iTSCs）形成中的作用时，发现SLiPERs同样不可或缺，这表明这些肽段在多种重编程过程中都发挥着关键作用。

那么SLiPERs是如何行使功能的呢？研究人员通过一系列精巧的实验发现，这些肽段并不影响OCT4的相分离能力或一般的转录激活功能，而是通过招募特定的蛋白质伴侣来实现其特异性功能。通过染色质免疫沉淀-选择性分离染色质相关蛋白（ChIP-SICAP）技术，团队鉴定出了与OCT4-SLiPERs相互作用的关键蛋白，包括TNIP2、UFD1L等。

其中TNIP2的功能机制尤其引人注目。研究人员发现，将TNIP2的C末端与OCT4-SLiPER突变体融合，能够完全恢复其重编程能力，这表明两者之间的物理相互作用对重编程至关重要。进一步实验表明，TNIP2通过促进染色质开放性来发挥功能，而不是依赖其已知的泛素结合能力。

为了验证这些发现在生理环境中的相关性，研究团队通过CRISPR-Cas9技术构建了SLiPER区域敲入突变的小鼠胚胎干细胞系。这些细胞在体外能够正常自我更新和分化为三个胚层，但在胚胎发育实验中，它们只能贡献到囊胚和早期原肠胚阶段，无法发育超过晚期原肠胚期。这表明SLiPERs对胚胎的正常发育至关重要。

在机制层面，研究人员发现删除SLiPERs会导致OCT4在基因组上的结合位点发生异常。突变体OCT4更多地结合在开放染色质区域，这些区域富含应激反应和凋亡相关基因，这可能是重编程效率降低的原因之一。同时，SLiPER突变还导致多能性基因Nanog的表达异常上调，这解释了为什么突变细胞在体外更难退出多能状态。

研究采用的主要技术方法包括：构建OCT4缺失突变体库进行功能筛选；使用条件性基因敲除系统（ZHBTc4.1）评估突变体功能；通过ChIP-SICAP结合质谱分析鉴定OCT4的染色质相关蛋白互作组；利用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除和敲入细胞系；采用ATAC-seq分析染色质可及性变化；使用人原代成纤维细胞和鼠胚胎成纤维细胞进行重编程实验。

研究结果首先显示，短线性肽 within OCT4是重编程所必需的。通过系统性筛选OCT4缺失突变体，研究人员发现N端和C端内在无序区中的特定区域（SLiPERs）对诱导iPSC形成至关重要，但这些区域对ESC自我更新却非必需。这些SLiPERs区域具有较高的分子识别特征（MoRF）倾向性，提示它们可能通过与特定蛋白伴侣的相互作用来发挥功能。

多能性和滋养层干细胞由不同OCT4结构域诱导。研究发现OCT4-SLiPERs在人类iPSC和iTSC重编程中同样发挥关键作用，且这种功能在物种间保守。值得注意的是，删除某些非SLiPER区域（如a.a.95-117）能增强iPSC重编程效率，但对iTSC形成没有显著影响，表明OCT4在不同重编程过程中利用不同的功能模块。

删除SLiPERs驱动重编程中OCT4的异常染色质结合。研究表明SLiPER突变不影响OCT4的相分离能力或一般转录激活功能，但会导致OCT4结合位点的重新分布。突变体OCT4更多地结合在开放染色质区域，这些区域缺乏典型的OCT4结合 motif，且与应激反应和凋亡相关基因相邻，这可能是重编程效率降低的原因。

OCT4在重编程过程中 engages 独特的蛋白质组。通过ChIP-SICAP和质谱分析，研究人员发现OCT4在早期重编程阶段和ESC中招募不同的蛋白质伴侣。在重编程过程中，OCT4更多地与GATA2、PBX1等体细胞因子相互作用，而在ESC中则主要与LIN28A、L1TD1等多能性网络蛋白结合。这种差异不能单纯用蛋白质丰度来解释，表明存在特异的相互作用。

TNIP2挽救OCT4-SLiPER突变体的重编程功能。研究人员发现TNIP2是OCT4-SLiPERs的关键相互作用蛋白之一。有趣的是，将TNIP2的C末端与OCT4-SLiPER突变体融合可以完全恢复其重编程能力，而单独共表达则无此效果。机制上，TNIP2通过促进染色质开放性来发挥作用， knockdown TNIP2会显著减少OCT4靶位点的染色质可及性。

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OCT4 SLiPERs是胚胎发育越过晚期原肠胚所必需的。通过基因编辑技术构建的Pou5f1^lin/Δ小鼠ESC在体外能维持自我更新和多能性，但在胚胎嵌合实验中只能贡献到早期发育阶段，无法发育超过E8.5。这些细胞在分化方面存在缺陷，在无LIF条件下仍倾向于自我更新，表明SLiPERs对正常的谱系特化至关重要。

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删除SLiPERs驱动ESC中OCT4的异常结合。在Pou5f1^lin/Δ ESC中，OCT4结合位点显著增加，且更多地位于可及染色质区域。突变体OCT4在核小体上的 motif 读码也发生改变，更多地与SOX motif 共定位。这些异常结合位点与核糖体DNA染色质沉默相关，而不是发育或多能性相关基因，这可能是突变细胞分化异常的原因。

本研究最终得出结论：OCT4通过其内在无序区中特异的短线性肽段（SLiPERs）来实现细胞类型特异性功能。这些肽段在重编程过程中招募TNIP2等特异性蛋白伴侣，促进染色质开放性，从而调控基因表达程序。相比之下，在干细胞自我更新中，OCT4的功能更加通用，可以被其他区域替代。这一发现不仅解释了OCT4功能多样性的分子基础，也为理解转录因子如何通过内在无序区实现功能特异性提供了新范式。

该研究的重要意义在于揭示了转录因子功能特异性的新机制，挑战了以往认为IDR主要介导通用功能（如相分离）的观点。研究发现IDR中包含着功能特异的模块，这些模块通过招募不同的蛋白伴侣来适应特定的细胞环境。这一发现对干细胞生物学和再生医学具有重要启示，为改进重编程策略和开发新的细胞命运操控工具提供了理论基础。同时，研究也表明转录因子的功能模块化可能是一个普遍原理，这为研究其他发育重要转录因子提供了新思路。