X染色体基因剂量补偿新机制：RNA与蛋白质水平的基因特异性反式上调

为解决哺乳动物X染色体剂量感知与补偿机制不明的问题，研究人员开展X染色体上调（XCU）研究，发现细胞通过基因特异性反式上调机制在RNA和蛋白质水平实现剂量补偿，且该机制同样适用于常染色体。该研究揭示了哺乳动物基因剂量补偿的分子基础，对理解Turner综合征等疾病具有重要意义。

　　

在哺乳动物发育过程中，基因剂量补偿机制至关重要。雌性哺乳动物通常有两条X染色体，而雄性只有一条X和一条Y染色体，这种X连锁基因剂量的不平衡被认为推动了X连锁剂量补偿机制的进化。在雌性哺乳动物中，两条X染色体中的一条会表达长链非编码RNA Xist并在早期发育过程中被失活，称为X染色体失活（XCI）。结果，雌性体细胞中只有一条活性X染色体，与雄性XY体细胞相同。

然而，最近的研究表明，细胞能够感知X染色体的数量。两条X染色体中的一条丢失或失活后，剩余活性X染色体会发生上调，这一过程称为X染色体上调（XCU）。但细胞如何感知X染色体剂量并诱导XCU仍不清楚。此外，常染色体基因剂量的改变是癌症和早期人类IVF胚胎的标志，但基因沉默是否能诱导常染色体剂量补偿尚不明确。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，通过CRISPR-Cas9技术在雌性XX小鼠多能干细胞（PSCs）中产生大的杂合性X连锁缺失，结合等位基因和分子分辨率的单细胞和批量转录组学以及定量蛋白质组学，测量了缺失对基因表达的影响。研究发现，在缺失区域内特异性发生反式剂量补偿，表现为转录和蛋白质水平的增加。此外，研究还发现，当两个等位基因中的一个在顺式被灭活时，常染色体基因也能发生反式转录剂量补偿。

研究人员主要运用了几个关键技术方法：利用CRISPR-Cas9生成X染色体大片段杂合缺失的细胞系；采用Smart-seq3xpress单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术提供全转录本覆盖度和等位基因特异性分辨率；通过批量RNA测序（RNA-seq）分析X连锁和常染色体基因表达；运用定量蛋白质组学（质谱分析）检测蛋白质水平的变化；使用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析组蛋白翻译后修饰（hPTMs）；并通过等位基因特异性定量PCR（qPCR）验证特定基因的补偿情况。样本来源包括杂交（Mus musculus musculus × Mus musculus castaneus）小鼠的多能干细胞系。

等位基因和分子分辨率分析XCU在小鼠PSCs中的情况

研究人员使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术分析了具有不同基因型的小鼠多能干细胞（PSCs）。细胞系来源于两种小鼠亚种（Mus musculus musculus × Mus musculus castaneus, Mus/Cast）的杂交。通过Smart-seq3xpress方法，获得了全长转录本覆盖和利用独特分子标识符（UMIs）计算转录本数量的能力。根据约1750万个单核苷酸多态性（SNPs），将转录本按来源等位基因拆分，提供了等位基因特异性分辨率数据。

研究发现，当只有一个活性X染色体存在时，X连锁基因的等位基因表达水平显著升高。XO和XY细胞（统称为X单体型）中，X连锁基因的表达量高于XX细胞。X与常染色体比率（X:A）分析证实，具有单个X染色体的细胞中X:A比率升高，而XCastXMus细胞没有显示增加的X:A比率。这些发现证实了在具有单个X染色体的二倍体细胞中存在XCU，并且小鼠PSCs能够感知X染色体的数量，并通过在只有一个Xa时进行XCU来适应基因表达。

鉴定受XCU影响的基因

在405个表达的X连锁基因中，有103个（约40%）在X单体型细胞中转录显著上调。这些上调的基因并不富集在特定的基因座，而是分布在整个X染色体上。在XX细胞中，在X单体型中上调的基因表达水平显著高于不受上调影响的基因。基因本体（GO）分析表明，上调的X连锁基因富集于染色质组织调控和核酸模板转录正调控等基本细胞功能，而非上调基因富集于视觉感知和轴突发生负调控等特定发育过程。

组蛋白翻译后修饰与XCU

为了探索组蛋白翻译后修饰（hPTMs）与XCU之间的潜在联系，研究人员分析了在可条件性诱导XCU的小鼠XX胚胎干细胞（ESCs）中的hPTMs。通过等位基因分辨率的ChIP-seq数据发现，在XCU过程中，活性标记H4ac、H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3保持高水平，而H3K9ac显著增加。这些结果表明，在XCI过程中活性标记变得 depleted，而在XCU过程中，一部分活性hPTMs变得更加富集或保持高水平。

无XCU中心的证据

研究人员假设X染色体上存在一个专用的调控位点，称为XCU中心（Xuc）。通过生成在XX mESCs中一个X染色体上具有大片段杂合缺失的细胞系，并分析其对基因表达的影响，发现缺失X染色体上的大片段并不足以在缺失区域外诱导全局性反式XCU。这些结果不支持任何被删除的片段作为Xuc能够反式诱导全局XCU的假设。

细胞感知大片段缺失并反式补偿基因表达

研究发现，细胞能够感知一个X染色体上特定片段的缺失，并通过反式转录上调在缺失区域内特异性进行剂量补偿。在13个X染色体的片段缺失中，XCU在缺失片段内反式被诱导。在基因水平上，在XCastOMus细胞中上调的基因在缺失系中一致上调，达到与XCastOMus细胞相似的表达水平。等位基因特异性分析证实了XCastOMus细胞中Cast等位基因的上调。

常染色体基因剂量补偿通过反式转录上调

研究人员利用可诱导常染色体基因顺式沉默的批量RNA-seq数据集发现，在顺式减少染色体3基因表达诱导了在80-160 Mb区域相应Mus等位基因的反式转录上调。这些结果表明，顺式减少常染色体基因表达可以通过反式转录上调得到补偿。

基因剂量在蛋白质水平的补偿

通过定量蛋白质组学分析，研究发现XMusY和XCastOMus ESCs中每个X染色体的X连锁蛋白质水平高于XCastXMus ESCs。具有一个活性X染色体的ESCs显示每个X染色体的X连锁蛋白质丰度超过XX ESCs中X连锁蛋白质丰度的一半。X:A比率分析证实，XCU在蛋白质水平发生。在159个检测到的X连锁蛋白质中，45个（38%）在XMusY和XCastOMus细胞中显著上调。与常染色体相比，X染色体上上调蛋白质的比例高度富集。

0.5 or<-0.5,respectively).d Barplot displaying the proportion of upregulated genes per chromosome.The X chromosome is highlighted in green.e Barplot showing the proportion of complex-forming proteins in the upregulated(green) and non-'>

研究结论表明，哺乳动物细胞能够感知X染色体和常染色体上特定片段或基因的杂合丢失或失活，并通过反式在转录和蛋白质水平的上调来补偿这些基因剂量的不平衡。XCU是在基因水平上调控的，以位点特异性方式涉及多个调控层面，以感知和补偿X连锁基因剂量的变化。这些发现对理解人类X染色体单体（Turner综合征）等疾病的机制具有重要意义，并表明哺乳动物基因组具有内在的能力来补偿由于基因组丢失或表达减少导致的基因剂量不平衡。