CRISPR-Cas7调控牙龈卟啉单胞菌宿主-病原体互作及其在牙周病进展中的新型致病机制

本研究深入探讨了牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）I-B型CRISPR-Cas系统中cas7基因的功能，发现其缺失会显著影响细菌的氧化应激（H2O2）抵抗能力、血凝活性及宿主免疫应答（TNF-α/IL-17）。通过双转录组分析揭示了cas7通过调控抗氧化基因（tpx/rbr）、血红素代谢（hemG/hmuY）和Ⅸ型分泌系统（T9SS）相关基因表达，进而影响细菌毒力和宿主炎症通路。该研究为CRISPR系统在细菌致病机制中的非经典功能提供了新见解。

　　

引言

牙周病（PD）是全球第六大流行疾病，是导致成人牙齿丧失的主要原因。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）作为革兰阴性厌氧菌，是牙周炎的关键致病菌。其成功定植与存活依赖于对宿主免疫系统与龈下微生物群失衡的诱导能力，尤其是在慢性炎症环境下抵抗活性氧（ROS）的能力。CRISPR-Cas系统最初被描述为细菌抵御噬菌体和外源核酸的防御机制，但近期研究表明其还参与细菌的氧化应激抵抗、毒力调控和免疫逃逸等生物学过程。临床研究发现，在疾病进展的牙周位点中，P. gingivalis的I-B型CRISPR-Cas系统相关基因表达显著上调，提示该系统在牙周病发展中具有潜在作用。

材料与方法

研究使用P. gingivalis ATCC 33277野生型（WT）和通过同源重组构建的Δcas7突变体（使用红霉素抗性基因ermF替换cas7编码区）。细菌在添加血红素（5 μg/mL）和甲萘醌（1 μg/mL）的胰蛋白酶大豆琼脂（BAPHK）或肉汤（TSBHK）中厌氧培养。通过生长曲线、生物膜形成（safranin染色法）、氧化应激（250 μM H₂O₂处理）、血凝试验（绵羊红细胞）评估表型变化。使用PMA分化的THP-1巨噬细胞样细胞进行感染实验（MOI=100），通过抗生素保护法测定细胞内存活率，Luminex多因子检测技术分析细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ等）表达。采用双转录组测序（dual RNA-seq）对2 h和6 h感染时期的宿主和细菌基因表达进行综合分析，并通过Galleria mellonella（大蜡螟）模型进行体内毒力评价。

结果

删除cas7对P. gingivalis体外生长和生物膜形成无显著影响

Δcas7突变体在浮游生长和生物膜形成方面与野生型无统计学差异，表明cas7缺失并不影响基础生长特性。

删除cas7影响氧化应激抵抗和血凝活性

Δcas7对H₂O₂的敏感性显著增加，在处理5 h和10 h后存活率明显降低。血凝试验显示突变体凝集红细胞的能力下降（稀释倍数降低），表明其获取血红素的能力受损，这可能影响其抗氧化应激所需的血红素层形成。

cas7缺失不影响细胞内存活但改变THP-1细胞的早期免疫应答

尽管Δcas7在THP-1细胞内的存活率与野生型相似，但其感染后在4 h诱导了更高水平的TNF-α、IL-17、IFN-γ、CCL3/MIP-3和GM-CSF。至6 h和24 h，细胞因子水平趋于一致，表明cas7缺失主要影响早期炎症反应。

删除cas7导致胞内感染期间基因表达谱显著改变

转录组分析显示，Δcas7在感染2 h和6 h后分别有94和112个基因差异表达。包括：抗氧化相关基因（tpx、ruberythrin/PGN_RS1450）和DNA修复基因（uvrA）表达改变；血红素代谢基因（flavodoxin、hemG、hmuY、hemT）表达下调；铁摄取相关基因（4Fe-4S、TonB受体）表达上调；毒力相关基因（tapC、T9SS组分）和新型黏附素PGN_RS07375表达增加。同时，cas6表达轻微上调，转座酶相关基因表达增加。

Δcas7突变改变THP-1细胞中与牙周病相关基因的表达

宿主转录组显示，与野生型感染相比，Δcas7感染的细胞中炎症相关基因（PELI1、ACOD1）、牙周炎正相关基因（IFI44、OASL）表达下调，而线粒体基因MT-ND3（与侵袭性牙周炎相关）表达上调。通路富集分析发现，6 h时“基底细胞癌”、“尼古丁成瘾”、“色氨酸代谢”等通路激活，而“系统性红斑狼疮”、“人乳头瘤病毒感染”等通路抑制。

删除cas7基因改变P. gingivalis在无脊椎动物模型中的毒力

在Galleria mellonella模型中，Δcas7感染导致幼虫存活率下降趋势高于野生型但低于Δcas3突变体，表明cas7缺失部分增强毒力，但效应不如cas3缺失显著。

讨论

本研究揭示了cas7在P. gingivalis致病机制中的多重作用。其缺失影响氧化应激抵抗、血凝活性及早期宿主炎症反应，这可能源于对血红素摄取和抗氧化基因表达的调控。双转录组学进一步表明，cas7通过影响细菌的抗氧化、铁代谢、DNA修复及T9SS相关基因表达，间接调节宿主免疫通路（如细胞因子信号和嗅觉受体活性）。与既往研究的Δcas3突变体相比，Δcas7表型较为温和，提示CRISPR-Cas系统内部存在功能补偿机制。这些发现不仅深化了对CRISPR系统在细菌致病中非经典功能的理解，也为探索牙周病治疗新靶点提供了方向。

数据可用性

基因表达数据已保存于NCBI GEO数据库（登录号：GSE300980）。

致谢

作者感谢佛罗里达大学UFIT研究计算中心提供的计算资源和支持。

作者贡献

Nicole de Mello Fiallos：研究实施、论文撰写与编辑；Alejandro Riveros Walker：研究实施与数据分析；Muhammed Irfan：研究实施；Jose Solbiati：研究实施与论文审阅；Jorge Frias-Lopez：课题构思、经费获取、数据分析、论文审阅；Frank C. Gibson III：课题构思、经费获取、数据分析、论文撰写与审阅。