纤毛外动力臂激活新机制：ARL3-GTP介导的Shulin释放调控ODA活化

本研究揭示了纤毛发生过程中外动力臂（ODA）激活的关键分子机制。研究人员发现包装伴侣蛋白Shulin（DNAAF9）在胞质中抑制ODA活性，而纤毛内小GTP酶ARL3在GTP结合状态下能够特异性识别Shulin的N1结构域，通过空间位阻效应促使Shulin从ODA-Shulin复合物中解离，从而实现ODA在纤毛内的特异性激活。这项工作解决了长期以来关于ODA如何在正确时空被激活的难题，为原发性纤毛运动障碍（PCD）的病理机制提供了新的理论依据。

　　

在真核生物世界中，纤毛如同细胞的"天线"和"桨叶"，既负责感知外界信号，也驱动细胞运动或液体流动。这些微小的细胞器其内部蕴藏着精密的分子机器——轴丝动力臂系统，其中外动力臂（outer dynein arms, ODAs）是产生动力的核心引擎，而内动力臂（inner dynein arms, IDAs）则负责调节搏动波形。当这些动力臂出现故障时，会导致一种严重的遗传性疾病——原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia, PCD），患者表现为慢性呼吸道感染、不育症和内脏异位等症状。

在纤毛发生过程中，细胞面临着一個有趣的难题：ODAs在胞质中预先组装后，需要经过长达数微米的运输路程才能到达纤毛尖端并锚定在微管双联体上。在这段旅程中，如果ODAs提前激活，其强大的马达活性将会产生破坏性的副作用。自然界的解决方案是给这些"发动机"装上"刹车系统"——包装伴侣蛋白Shulin。在纤毛虫Tetrahymena thermophila中的研究发现，Shulin能够与ODAs结合，使其保持闭合的抑制状态。然而，这个刹车系统如何在正确的时间和地点被释放，即Shulin如何从ODAs上解离以激活运动功能，一直是个未解之谜。

为了回答这个基础生物学问题，由Karim Housseini B. Issa和Muyang Ren等研究人员组成的国际团队开展了系统研究，他们的研究成果发表在《Nature Structural & Molecular Biology》期刊上。研究人员通过多种实验技术手段，包括蛋白质组学分析、体外重组实验、点突变研究和结构生物学方法，揭示了DNAAF9（人类Shulin同源蛋白）与哺乳动物ODA亚基、IFT蛋白以及纤毛小GTP酶ARL3之间的相互作用网络。他们发现DNAAF9和Shulin都优先结合活性状态的Arl3-GTP，显示了这一相互作用的跨物种保守性。GTP结合的Arl3能够接近、结合并从包装的ODA-Shulin复合物中置换Shulin。基于这些发现，研究人员提出了一种模型：当被抑制的ODA复合物进入生长中的纤毛后，Arl3-GTP置换Shulin（DNAAF9）并将其与ODAs隔离，从而特异性在纤毛内部促进其运动功能的激活。

研究人员主要采用了几个关键技术方法：使用人气管上皮细胞（HAECs）气液界面培养模型模拟多纤毛细胞分化过程；通过免疫共沉淀联合串联质谱标签（TMT）质谱技术绘制DNAAF9相互作用组；利用蔗糖密度梯度离心纯化猪气管纤毛ODA复合物；采用负染色电子显微镜单颗粒分析技术观察蛋白复合物结构变化；通过AlphaFold2和AlphaFold3进行蛋白质结构预测和复合物建模；建立Tetrahymena纤毛再生系统进行体内功能验证；使用大小排阻色谱分析蛋白质相互作用和置换效应。

DNAAF9进入生长中的人气道细胞运动纤毛并与哺乳动物ODAs结合

研究人员首先验证了DNAAF9在人类系统中的功能保守性。使用气液界面（ALI）培养的人气道上皮细胞（HAECs）模型，他们发现DNAAF9信号在纤毛生长早期（ALI第19天）集中在基体附近并出现在短小的生长纤毛中，而在更成熟的细胞（ALI第45天）中，DNAAF9信号在胞质中更分散，在较长纤毛中的水平也有所降低。这表明DNAAF9能够进入纤毛室，且在生长纤毛中更为富集。通过免疫共沉淀质谱分析，研究人员从不同分化阶段的HAECs中鉴定出DNAAF9的结合蛋白，发现人类ODA全复合物亚基（DNAH5、DNAH9、DNAI1和LC3/NME9）都与DNAAF9共沉淀。Western blot分析进一步证实了DNAAF9与ODA中间链DNAI2的相互作用。

DNAAF9与纤毛形成相关蛋白在气道细胞成熟过程中发生相互作用

除了ODA亚基，DNAAF9的早期和中期相互作用组还包括纤毛小GTP酶ARL3、几种IFT蛋白和一些胞质动力蛋白1运输 machinery亚基。基因本体（GO）富集分析显示，在EC和MC相互作用组共同的87个蛋白中，IFT-B和纤毛尖端蛋白显著富集。研究人员还发现了在细胞阶段特异性方式下与DNAAF9独特共沉淀的蛋白：来自ECs（包含基底、早期和中期细胞阶段的混合）的DNAAF9相互作用组包含更多胞质蛋白，而来自MCs（包含早期、中期和成熟细胞阶段的混合）的相互作用组则包含更多中心体、基体和轴丝蛋白，包括纤毛尖端蛋白、ODA锚定复合物亚基和微管内蛋白。这一观察表明DNAAF9的相互作用在气道细胞多纤毛发生过程中发生变化，这可能与其在纤毛货物运输中的细胞功能相关。

ARL3-GTP在体外结合DNAAF9并从生长中的Tetrahymena纤毛中拉低内源性Shulin

研究人员通过分析大小排阻色谱发现，只有Arl3-Q70L（GTP模拟突变体）与DNAAF9共洗脱，即使存在GDP的情况下也是如此，这可能是因为其稳定的GTP锁定构象。这些跨物种重组实验表明DNAAF9-ARL3复合物在进化上是保守的。使用重组Tetrahymena Arl3-Q70L作为诱饵和去纤毛后 undergoing纤毛再生的Tetrahymena细胞裂解液进行 pulldown实验，质谱分析鉴定出几个Arl3的已知效应物和Shulin。这表明人类DNAAF9和Tetrahymena Shulin都优先结合ARL3和Arl3的GTP锁定活性变体。

ARL3结合DNAAF9的N末端结构域

负染色电镜单颗粒分析提供了明确的二维类别平均图。与Shulin（PDB 6ZYX_8）的计算二维投影谱比较显示，在DNAAF9/Shulin的N末端N1结构域附近存在一个额外的密度，这个密度在大约一半的类别平均图中不存在。研究人员得出结论，这些类别平均图分别代表DNAAF9和Shulin单独存在以及与结合N1结构域的Arl3形成的复合物。通过AlphaFold-Multimer预测生成了DNAAF9-ARL3复合物的结构模型，预测ARL3以GTP加载构象结合到DNAAF9的N1结构域，与二维类别平均图一致。

活性Arl3结合并从ODAs上置换Shulin

研究人员首先将纯化的Tetrahymena ODAs与重组Shulin重组，诱导其形成"phi"状闭合构象。然后通过将纯化的ODA-Shulin复合物等分，并在饱和GTP（1mM）水平下与过量的GTP锁定Arl3-Q70L变体或不能强结合Shulin的Arl3-Q70L;FYY突变体一起孵育，进行体外置换实验。通过大小排阻色谱解析所得复合物。峰分部中条带强度（凝胶密度测定）的定量显示，在Arl3-Q70L;FYY存在下，与ODA全复合物亚基（HCs和IC2）共洗脱的Shulin水平高于Arl3-Q70L存在下的水平。这表明添加活性Arl3对纯化的ODA-Shulin复合物具有 destabilizing效应，并置换大部分结合的Shulin。

结构建模显示，Arl3和ODAs在Shulin的N1结构域上的结合位点不同。虽然这些位点没有直接重叠，但将Shulin-Arl3预测叠加到ODA-Shulin的冷冻电镜引导结构上时，突出了Arl3和ODA HCs之间的空间位阻冲突。置换实验和结构研究共同提供了一个分子解释，说明活性Arl3的结合如何通过冲突 destabilize ODA-Shulin复合物，最终促进Shulin的释放和隔离。

这项研究揭示了ODA在纤毛内首次激活的分子解释。研究表明包装伴侣蛋白Shulin被纤毛GTP酶Arl3从Tetrahymena ODAs上置换，从而促进马达激活。基于Arl3与Shulin及其人类同源蛋白DNAAF9相互作用的保守性，研究人员提出ODA激活机制在几种纤毛生物中是保守的。

DNAAF9与ARL3（一种普遍表达的GTP酶）的相互作用表明，在后生动物中，它可能对除了我们在此定义的功能之外的其他功能也很重要。虽然DNAAF9变异尚未在纤毛病患者中报道，但DNAAF9突变体会出现轻度至重度脑积水，这与在运动纤毛功能中发挥作用一致。研究人员提出，DNAAF9可能在维持哺乳动物纤毛运动功能方面具有重要功能，应该被视为具有原发性和运动纤毛缺陷联合特征的综合征性纤毛病的候选基因。

研究人员确定了DNAAF9的另一个关键分子功能（即在人气道细胞中运输ODA）。基于其相互作用和在生长多纤毛基部的亚细胞浓度，研究人员推测DNAAF9可能 chaperone包装ODAs在多纤毛细胞中与IFT trains的附着。研究人员提出包装ODAs与IFT的耦合可能由IFT74-IFT81二聚体介导。

这项工作将ARL3的功能扩展到包括调节ODA运输及其在运动纤毛中的适时激活。ARL3的完全缺失在脊椎动物中是致死的，功能缺失型ARL3变异通常与严重的原发性纤毛病相关，原因是纤毛信号受体运输受损。Arl3对利什曼原虫运动鞭毛的形成至关重要。最近使用布氏锥虫的工作也发现了Arl3与Oda16之间的相互作用，后者被提议作为运动相关货物（如中央对成分HYDIN）的纤毛运输的效应物。研究人员的工作和这些其他发现表明，在运动纤毛形成过程中，ARL3与运输因子（如DNAAF9/Shulin和Oda16）之间存在复杂的相互作用。

多纤毛细胞中轴丝动力蛋白生物合成和运输的庞大规模可能需要多个因子在几个步骤中发挥作用以将ODAs集中在生长纤毛周围和内部。关键的是，关闭ODA马达活性的需求对于防止沿运输路线发生异常的脱靶相互作用至关重要。虽然IFT系统中可能存在 upon结合强制执行ODA抑制的内在机制，但研究人员更倾向于一个模型，即Shulin的关键抑制作用可能是需要稳定IFT-ODA相互作用以便在Tetrahymena中有效运输到纤毛内。虽然猪ODAs在DNAAF9存在下采用闭合构象的观察可能暗示其在哺乳动物ODAs中的抑制作用（类似于Shulin在Tetrahymena ODAs中的作用），但未来需要使用哺乳动物ODAs进行更多的功能 assay来直接测试这一点。一旦进入纤毛内部，研究人员提出GTP结合构象的Arl3促进Shulin从ODAs上释放并将其隔离以防止重新结合。Shulin-Arl3复合物可能通过扩散或IFT退出纤毛以进行回收或降解。