结核病（TB）是由结核分枝杆菌通过空气传播到肺泡引起的，目前仍是一个全球性的健康危机，每年约有1000万新病例[1,2]。早期诊断TB对于改善疾病控制至关重要，因为适当的治疗可以迅速降低患者的传染性[3,4]。多项研究表明，感染结核分枝杆菌的免疫细胞分泌的多种细胞因子可以作为TB的生物标志物[5,6]。其中，干扰素-γ（IFN-γ）是一种关键的细胞因子，已被广泛验证为TB的诊断生物标志物[7,8]。同样，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在肉芽肿形成和宿主对抗结核分枝杆菌的过程中起着关键作用，也成为一种有前景的TB检测生物标志物[9,10]。普遍认为，同时检测多种疾病生物标志物可以提高诊断的准确性[11,12]。因此，开发用于并行检测TB生物标志物的多重免疫测定方法将显著提高诊断的可靠性和精确度，从而更有效地预防和控制TB的传播。
当前的TB诊断方法存在显著局限性。结核菌素皮肤试验（TST）由于与环境中的分枝杆菌及BCG疫苗的交叉反应而特异性较差[13,14]。虽然干扰素-γ释放试验（IGRA）具有更高的特异性，但其需要新鲜血液样本、过夜孵育以及专门的实验室设施，这大大限制了其在临床和资源有限环境中的广泛应用[[15], [16], [17]]。目前，电化学发光（ECL）作为一种强大的分析技术，在生物测定中结合了电化学和化学发光的优势[[18], [19], [20], [21]]。迄今为止，已经开发出一些简单、高灵敏度且成本效益高的电化学和ECL检测方法来分析TB生物标志物[[22], [23], [24], [25], [26]]。尽管在TB诊断方面取得了显著进展，但由于两个关键限制，开发能够检测微量TB生物标志物的多重ECL测定方法仍然具有挑战性：（i）缺乏在正电位下高效工作的ECL探针；（ii）ECL信号强度不足以定量低丰度的TB生物标志物[[27], [28], [29], [30]]。因此，开发具有明确电位信号的多重生物传感平台是一个重大挑战，特别是对于旨在单次电位扫描中检测多种TB生物标志物的测定方法。为了确保精确检测，ECL探针的不同峰必须分离良好且具有光谱差异[31]。此外，还需要考虑探针的四个关键特性：（i）优异的生物相容性；（ii）可控的表面功能化；（iii）延长的信号稳定性；（iv）在复杂生物基质（如血清）中的优异抗干扰能力——这有助于在生理条件下（PBS缓冲液，pH 7.4，37°C）实现稳健的生物标志物检测。此外，为了消除交叉反应和信号干扰，不同的ECL探针必须在电极表面上以超过微米级的距离空间分离[32]。鉴于这些限制，开发能够在单次扫描中同时定量两种TB生物标志物的电位分辨多重生物传感平台仍然是一个重要的技术挑战。
构建多重生物传感平台的关键挑战在于制备具有明确电位信号的ECL纳米探针。在这项工作中，我们使用了合成的碳量子点（CQD）和金纳米簇（AuNC）来制备这些探针，因为它们满足上述要求，并且在生物分析中得到了广泛应用。这两种探针在?2.0 V和+1.2 V（相对于Ag/AgCl）的电位下产生了分离良好的ECL信号。大量研究表明，金纳米粒子（AuNP）和磁珠（MB）通过增加发光探针的富集量显著提高了ECL免疫传感器的灵敏度[[33], [34], [35], [36]]。利用这种方法，我们通过将高密度ECL发射体与金纳米粒子（AuNP）结合，然后通过磁珠（MB）辅助富集，制备出信号放大的ECL复合探针。此外，根据我们之前发表的协议[37]，制备了具有双独立区域的图案化氧化铟锡（ITO）电极，以消除复合探针之间的信号干扰。针对IFN-γ和TNF-α的一抗（Ab1）被固定在ITO电极的不同区域，用于捕获各自的TB生物标志物，随后使用二抗（Ab2）修饰的复合探针进行检测。这种多重生物传感平台能够同时定量两种TB生物标志物，为提高TB诊断的精确度、可靠性和早期检测灵敏度提供了重要潜力。
