综述：心脏发生与先天性心脏病的细胞类型体外建模

这篇综述系统阐述了利用人多能干细胞（hPSC）体外定向分化技术模拟心脏发生过程中各类细胞谱系的最新进展。作者重点探讨了如何通过精确调控信号通路（如WNT、BMP、FGF、RA等）生成心室/心房心肌细胞、房室管细胞、心外膜、内皮/心内膜、传导系统细胞等，并强调了这些模型在解析先天性心脏病（CHD）特别是单心室畸形等复杂病变的分子机制中的关键价值，为疾病建模和药物筛选提供了强大平台。

　　

1. 引言

先天性心脏病（CHD）是最常见的出生缺陷之一，在活产婴儿中发病率接近1%，是导致婴儿死亡的主要原因。尽管基因组测序技术取得了进步，对心脏发育必要基因的理解也日益加深，但大多数CHD病例的病因仍不明确。动物模型（如小鼠、鸡、斑马鱼）在揭示心脏发育的细胞和分子机制方面发挥了重要作用，但其在模拟某些复杂CHD（如单心室 disorders）方面存在局限性。近年来，单细胞基因组学、谱系追踪和活体胚胎成像技术的突破，揭示了心脏发育中离散细胞类型的精确时空动态。这些发现为开发新的人多能干细胞（hPSC）方法以生成心脏发生过程中的多种细胞类型提供了信息。一个关键的统一主题是，多能心脏祖细胞对心脏分化各个阶段施加的信号因子的微小变化都异常敏感。本综述将概述我们对心脏发育的当前理解，并系统调查体外hPSC方法以生成组成哺乳动物心脏的多种细胞类型。

2. 心脏发生概述

心脏发育始于原始条纹内迁移性祖细胞的高度协调的时空相互作用。命运图谱和克隆谱系标记实验表明，心脏祖细胞亚群组成了心脏的不同区域。回顾性克隆分析确立了心脏由至少两个亲本心肌谱系形成的范式：第一心场（FHF）和第二心场（SHF）。随后的单细胞转录组分析进一步证实了在原肠胚形成至心脏新月阶段，存在分子谱预先配置为未来心脏结构的细胞。除了心肌细胞，心脏的正确形态发生还需要许多其他细胞类型的加入，包括内皮/心内膜细胞、瓣膜间质细胞、神经嵴细胞、心外膜细胞、传导系统心肌细胞和驻留心脏巨噬细胞。

3. 心室心肌细胞

心室心肌细胞是驱动收缩力以将血液泵送到肺（肺循环）和身体（体循环）的主要力量。从hPSC生成心室心肌细胞的方案已经非常成熟，其中最广泛使用的是基于小分子WNT调控的方案：初始应用CHIR99021激活WNT信号以诱导中胚层形成，随后应用IWP-4或WNT-C59抑制WNT信号以促进心脏 specification。这些方案产生的心肌细胞不成熟，对应于小鼠心脏发育的胎儿阶段。这些模型已被广泛用于模拟CHD和成人心脏疾病，例如用于揭示GATA4、GATA6、TBX5等转录因子剂量减少或功能缺失如何影响核心心脏生成基因调控网络和蛋白质相互作用，从而导致室间隔缺损等病变。

4. 心房心肌细胞

心房心肌细胞具有较短的动作电位时程，其心肌层厚度也较薄。在发育中，大部分心房心肌细胞来源于第二心场的后部区域。视黄酸（RA）信号是心房祖细胞初始特化的关键决定因素。借鉴小鼠和鸡胚胎的知识，在体外分化方案中，在心脏中胚层特化后（约第3-5天）应用RA是使分化轨迹向心房心肌细胞命运倾斜的关键调制。功能记录证实了这些细胞具有心房特有的电生理特性，为临床前识别心房选择性抗心律失常药物奠定了基础。

5. 房室管心肌细胞

房室管（AVC）是胚胎心脏中的一个瞬态结构，促进心房和心室腔之间的血流。它包含特殊的心肌细胞，分泌BMP因子诱导心内膜细胞发生内皮-间质转化（EndMT），形成瓣膜间质细胞，并对心脏传导系统的形成起关键作用。2024年的两项研究提供了生成AVC样心肌细胞的体外方法。关键发现是，在心脏中胚层特化后重新激活WNT信号（例如在分化第11天应用CHIR99021）对于使腔室心肌命运向AVC心肌倾斜非常重要。这些细胞表现出独特的基因表达谱和电生理特性，为理解房间隔缺损和心律失常的机制提供了新的机会。

6. 心外膜、平滑肌和成纤维细胞

心外膜是覆盖心脏外表面的薄间皮层，对心脏发育和损伤后修复至关重要。它来源于心外膜前体器官（PEO），其形成依赖于RA信号。多个研究小组开发了从hPSC生成心外膜细胞的方案，这些方案通常涉及在心脏中胚层阶段对BMP和WNT信号进行微调。心外膜细胞随后可以通过上皮-间质转化（EMT）分化为冠状动脉血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞。值得注意的是，血管平滑肌和心脏成纤维细胞可以由不同的发育谱系形成，源自不同谱系历史的细胞具有异质性的转录状态，并以独特的方式促进先天性和成人心血管疾病的进展。

7. 内皮、心内膜和瓣膜间质细胞

内皮和心内膜细胞都以独特的方式对心脏发育和先天性心脏病至关重要。生成血管内皮细胞的方案已经得到改进，可以区分动脉和静脉内皮细胞。相比之下，生成（并在分子上定义）心内膜细胞的能力直到最近才被报道。关键区别因素包括心脏转录因子NKX2-5的表达和NRG1信号。心内膜细胞对血流剪切力作出反应，并在接受BMP信号后能够启动EndMT，形成瓣膜间质细胞。这些模型已被用于研究NOTCH1单倍体不足等如何导致瓣膜钙化，并揭示了其在二尖瓣脱垂等疾病中的作用。

8. 心脏传导系统细胞类型

协调心房和心室心肌细胞的收缩对于血流的传播是必需的。专门的调节电活动的心肌细胞从早期线性心管阶段就存在，并最终形成一个包围心脏以维持节律性活动的心脏传导网络。多能干细胞模型主要集中于窦房结（SAN）细胞的生成，其方案依赖于在心脏中胚层诱导阶段应用RA或重新激活WNT信号，以阻断向心肌细胞的进展并促进SAN心肌细胞。最近，研究也开始开发生成房室结和心脏浦肯野纤维的方案，例如通过调控NOTCH信号。在3D心脏类器官或聚集体中进一步表征这些细胞，代表了模拟人类心脏发育全部复杂性的一个新前沿。

9. 心脏发生的三维（3D）模型的出现

尽管在生成心脏细胞类型方面取得了巨大进步，但二维（2D）分化方法固有的局限性仍然是一个主要问题。3D模型（如类器官、心脏球）有望解决这些问题，它们可以更好地模拟空间组织、细胞-细胞/细胞-基质相互作用、生物力学线索和形态发生模式过程。2021年的一系列论文宣告了3D分化方法在心脏发育生物学中的出现。这些方法表明，hPSC聚集体在经历双相WNT调制后，可以形成包含心肌细胞以及内胚层、心外膜和心内膜细胞的多细胞3D结构，并显示出血管管网形成的证据。随后的研究通过精确优化生长因子和小分子的组合条件，成功生成了自我组装的心脏类器官，这些类器官能够特化为特定的心场（FHF和SHF）及其衍生物（如左心室、右心室、心房和AVC），并表现出独特的电生理特性。这些进展突出了3D系统在理解心脏发育和CHD方面的巨大潜力。

10. 单心室疾病的多能干细胞模型

单心室疾病是一种罕见但危及生命的复杂CHD形式，患儿出生时右心室或左心室腔严重发育不全。其病因可能涉及血流动力学改变和心肌内在机制，并且很可能是由环境、血流动力学和遗传因素共同引起的。由于对潜在基因了解不完全以及表型的谱系和不完全外显率，在动物中建立可靠的模型一直具有挑战性。因此，人类体外系统在提供疾病形成机制理解方面发挥着重要作用。来自HLHS患者的hiPSC已被用于定向分化为心脏谱系，研究揭示了心肌细胞分化受损、心脏基因表达减少、收缩性缺陷、线粒体功能障碍以及内皮/心内膜细胞功能异常（如血管生成和EndMT潜能降低）等现象。这些研究强调了体外心肌细胞分化模型的效用和局限性，并指出未来需要利用更新的心内膜分化方案和流体剪切应力来探索心肌和心内膜细胞之间失调的串扰。

11. 结论与未来方向

利用多能干细胞生成心脏器官发生所需的各种细胞类型的最新进展，为更好地定义CHD病因和开发新的治疗干预措施提供了令人兴奋的新机会。未来的一个重点领域将是全面定义细胞间通讯如何在心脏发育的离散时间点影响细胞类型特异性的基因调控网络。心脏类器官和其他3D聚集体模型可能是解决这些问题的理想选择；然而，需要改进以可重复地重建小梁化、致密化、间隔化和肌肉收缩电耦合背后的复杂细胞组织。还需要考虑在体外聚集体内应用血流动力学剪切应力和血流的新方法。机器学习、蛋白质结构预测和单细胞基础模型等新的计算工具都可以被利用来更好地理解心脏发育中复杂的细胞相互作用。