IDR诱导CAR相分离增强CAR-T细胞对低抗原癌细胞的杀伤作用

本研究通过将内在无序区（IDR）与CAR融合，成功诱导了CAR的相分离（biomolecular condensation），显著提升了CAR-T细胞对低抗原表达癌症（如CD19low、HER2low）的抗原敏感性和细胞毒性，且未引发抗原非依赖的自发激活，为克服CAR-T疗法在实体瘤和复发肿瘤中的局限性提供了新策略。

　　

IDRs promote CAR condensation

研究团队选用了六种已知可诱导细胞环境相分离的内在无序区（IDR），包括来自FUS、EWS、TAF15、Nup98、TDP43和一种合成IDR（synIDR），并将其融合至靶向CD19的CAR（单链抗体FMC63）的C末端。CD19 CAR的结构包括CD8α的茎区和跨膜结构域，以及来自41BB、CD28和CD3ζ的胞内信号域。IDR后还连接了超折叠GFP标签，便于可视化观察。

实验结果表明，与对照CAR相比，融合了FUS、EWS或TAF15 IDR的CAR在T细胞膜上形成更显著的凝聚体，且这一过程不影响CAR的表面表达。通过全内反射荧光显微镜（TIRF）观察，这些IDR CAR在静息和刺激条件下均显示出更高的聚类水平（以归一化方差量化）。荧光恢复后漂白（FRAP）实验进一步揭示，EWS凝聚体的稳定性较高，而FUS和TAF15凝聚体流动性较强。值得注意的是，IDR CAR并未在无抗原情况下引发自发激活，表现为无增殖、CD69表达未升高、无肿瘤坏死因子α（TNFα）、干扰素γ（IFNγ）和白介素2（IL-2）分泌。

IDR from FUS enhances the cytotoxicity of CD19 CAR-T

为评估IDR对CAR-T细胞毒性的影响，研究以表达高或低水平CD19的Nalm6细胞（B细胞白血病系）为靶点，与对照或IDR CAR-T共培养。体外杀伤实验显示，FUS和EWS IDR CAR-T对CD19^high和CD19^low Nalm6均表现出更强的杀伤活性，且这一现象在Raji B细胞系中得以重复。机制上，当与CD19^low Nalm6共育时，FUS和EWS CAR-T分泌的颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、FasL和IFNγ等细胞毒性因子显著增加。

在体内实验中，研究人员将CD19^low Raji B细胞静脉注射至免疫缺陷NSG小鼠，3天后输注对照、FUS或EWS CAR-T细胞。活体成像显示，FUS CAR-T显著抑制了肿瘤生长，且这一效果在不同供体来源的T细胞中均得到验证。表型分析表明，FUS组小鼠血液中CD8⁺ T细胞比例和颗粒酶B表达略有升高，衰竭标志物（如LAG3和PD1）表达降低。单细胞RNA测序进一步证实，FUS组中细胞毒性T细胞占比更高，衰竭相关基因（如PDCD1、CXCL13、PRDM1）表达下调。

IDRs from FUS and TAF15 enhance cytotoxicity of HER2 CAR-T

研究还将IDR策略拓展至靶向HER2的CAR（单链抗体H3B1），以评估其在实体瘤模型中的效果。体外实验显示，FUS和TAF15 HER2 CAR-T对表达高或低HER2的K562细胞、SKOV3（卵巢癌）和HT29（结肠癌）细胞均展现出更强的杀伤作用和细胞因子分泌。

在HT29皮下移植瘤模型中，FUS和TAF15 CAR-T显著抑制了肿瘤生长。表型分析发现，二者均能提高血液和肿瘤浸润T细胞中CD8⁺ T细胞比例和颗粒酶B表达，且肿瘤浸润T细胞数量增加。尽管衰竭标志物表达未显著下降，但整体结果表明FUS和TAF15 IDR可增强HER2 CAR-T在实体瘤中的细胞毒性。

IDRs from FUS and EWS enhance cytotoxicity of CD22 CAR-T

针对信号效率较低的CD22 CAR（单链抗体RFB4），研究构建了IDR融合版本。与野生型Raji B或Nalm6细胞（中等CD22表达）共育时，FUS和EWS CD22 CAR-T表现出更强的杀伤活性，且细胞毒性因子分泌略有增加。在Nalm6静脉移植瘤模型中，FUS和EWS CAR-T亦显示出更好的肿瘤控制效果。

IDRs promote the formation and signaling of CAR-T synapse

为阐明IDR增强CAR-T功能的机制，研究人员评估了免疫突触的形成和信号传导。发现FUS、EWS和TAF15 IDR均能提高CAR-T与靶细胞的结合率，并增强突触的机械强度（通过z-Movi技术测定）。此外，IDR CAR-T突触中CD45排斥程度更高，表明信号传导更为高效。

在信号动力学方面，IDR CAR-T与CD19^low Raji B细胞共育时，CD3ζ（Y142）和LAT（Y171）的磷酸化水平显著增强。Western blot分析进一步揭示，FUS CAR-T中ZAP70、PLCγ1、SLP76和ERK的磷酸化水平均升高，且钙离子内流增强，表明膜近端信号通路被激活。

Coiled-coil-mediated oligomerization reduces CAR-T activation

作为对比，研究还测试了卷曲螺旋（coiled-coil）介导的CAR寡聚化效果。结果显示，虽二聚化卷曲螺旋对CAR表面表达影响不大，但四聚和六聚化导致CAR表面定位显著减少，细胞结合率和活化水平下降，表明过度稳定的寡聚可能引发受体内化，不利于CAR功能。

Discussion

本研究通过IDR诱导CAR相分离，成功增强了CAR-T对低抗原表达肿瘤的杀伤作用，且未引起抗原非依赖活化。FUS IDR在所有测试模型中均表现一致改善，而TAF15和EWS的效果受CAR表达水平和信号强度调节。IDR与卷曲螺旋的对比进一步凸显了前者在提升CAR功能方面的独特优势。该策略为改进CAR-T疗法，特别是针对实体瘤和抗原逃逸复发肿瘤提供了新方向。