基于多壁碳纳米管和抗菌肽Temporin-PTA的纳米结构生物传感器用于细菌检测

《Electroanalysis》：Nanostructured Biosensor Based on Multiwalled Carbon Nanotubes and Antimicrobial Peptide Temporin-PTA for Bacterial Detection

快速检测革兰氏阴性菌与阳性菌的电化学传感器开发及性能验证。采用多壁碳纳米管（MWCNTs）和 temporin-PTA 抗菌肽构建传感器，通过电化学阻抗光谱（EIS）结合原子力显微镜（AFM）和红外光谱（FTIR）表征，证实MWCNTs-T-PTA平台在5分钟内可检测10-105 CFU/mL的细菌浓度，对革兰氏阴性菌（如铜绿假单胞菌）响应显著强于阳性菌（如金黄色葡萄球菌），其选择性源于肽-膜相互作用差异。

　　在当今全球公共健康领域，细菌感染仍然是一个严峻的挑战。随着耐药菌株的不断出现，传统的治疗手段正面临越来越多的困难。为应对这一问题，科学家们正在积极寻找新的检测方法，以提高诊断效率并降低医疗成本。在这项研究中，开发了一种基于多壁碳纳米管（MWCNTs）和抗菌肽Temporin-PTA（T-PTA）的电化学传感器，旨在实现对多种病原菌的快速、灵敏和特异性检测。该传感器能够检测常见的临床相关细菌，包括铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）、大肠杆菌（*Escherichia coli*）、枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）和金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*），其检测范围覆盖从101到10? CFU/mL的浓度区间，且仅需5分钟即可完成检测。这一性能使得该传感器在临床快速诊断中具有重要的应用潜力。

抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）作为一种天然来源的生物分子，近年来在生物传感和抗菌治疗领域受到广泛关注。它们通过与微生物膜的相互作用，表现出强大的抗菌活性。在众多AMP中，Temporin-PTA是一种源自两栖动物皮肤分泌物的抗菌肽，其结构具有亲脂性特征，能够有效地破坏细菌细胞膜，从而实现抗菌作用。此外，T-PTA的正电荷特性使其能够与带负电荷的细菌表面产生静电吸引，这种特性在电化学传感中尤为关键。通过将T-PTA固定在电化学传感器表面，可以显著提高其对目标微生物的识别能力，从而实现高灵敏度和高选择性的检测。

多壁碳纳米管（MWCNTs）因其独特的物理和化学性质，在电化学传感器中扮演了重要角色。它们具有良好的导电性，能够增强电子转移效率，提高传感器的响应速度和灵敏度。同时，MWCNTs的表面可以进行化学修饰，以便于与抗菌肽进行共价结合，从而稳定传感器的结构并提高其性能。在本研究中，通过循环伏安法（Cyclic Voltammetry, CV）和电化学阻抗谱（Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS）等方法，对MWCNTs的电沉积过程进行了系统分析，确保其在电极表面的均匀分布和良好固定性。这些步骤为后续的抗菌肽固定和微生物检测奠定了坚实的基础。

为了进一步验证传感器的性能，研究人员采用了原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）和傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）等技术，对传感器的表面形貌和化学特性进行了详细分析。AFM图像显示，随着T-PTA的固定，传感器表面的粗糙度显著增加，表明抗菌肽成功地结合到了纳米材料表面。而FTIR光谱则揭示了MWCNTs与CTAB之间的相互作用，以及T-PTA与电极表面的结合情况。这些结果不仅证明了传感器的组装质量，还提供了关于其与不同微生物相互作用的分子层面信息。

在电化学检测方面，研究人员使用了K?[Fe(CN)?]/K?[Fe(CN)?]作为红ox探针，通过EIS和CV技术监测传感器在不同细菌浓度下的响应变化。结果表明，随着细菌浓度的增加，电化学信号也呈现出明显的增强趋势，尤其是对革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌和大肠杆菌的响应更为显著。这与T-PTA对带负电荷微生物表面的高亲和力密切相关。此外，通过分析表面覆盖率（θ）和电荷转移电阻（R_CT）的变化，研究人员能够区分革兰氏阴性和阳性菌的差异，进一步验证了传感器的选择性。这种选择性使得该传感器在复杂的微生物样本中仍能保持较高的检测准确性。

从实验结果来看，该传感器在性能上表现出显著的优势。首先，它能够在极短的时间内完成检测，仅需5分钟即可获得结果，这与传统微生物培养方法需要24小时以上形成鲜明对比。其次，其检测灵敏度高，能够识别低至10 CFU/mL的细菌浓度，满足临床快速诊断的需求。此外，传感器的检测结果具有良好的重复性和稳定性，所有实验均在标准条件下进行，并通过三重重复实验验证其可靠性。这些特点使得该传感器不仅适用于实验室研究，还具有实际应用的潜力，尤其是在临床微生物检测和环境监测等领域。

与其他基于抗菌肽的传感器相比，该研究提出的MWCNTs-T-PTA传感器在多个方面表现出优越性。例如，与使用金纳米颗粒或随机肽混合物的传感器相比，T-PTA在MWCNTs上的固定方式更稳定，能够有效避免非特异性结合，提高检测的准确性。此外，该传感器在检测不同细菌时表现出不同的电化学响应，这与其表面特性以及细菌细胞膜的组成密切相关。革兰氏阴性菌由于其外膜中含有丰富的脂多糖（LPS），通常表现出更强的电化学信号，而革兰氏阳性菌由于其厚壁的肽聚糖层，与传感器的相互作用相对较弱。这些差异使得该传感器能够在复杂样本中区分不同种类的细菌，为微生物检测提供了更全面的解决方案。

从应用角度来看，该传感器不仅能够用于临床样本的快速检测，还适用于环境样本的微生物分析，例如食品、水体和医疗设备表面的细菌污染检测。由于其无需标记（label-free）的特点，该方法可以避免复杂的样品预处理步骤，从而提高检测的便捷性。此外，传感器的检测过程可以在室温下完成，无需额外的温度控制设备，这进一步降低了其应用成本和操作难度。这种非侵入性、快速且高灵敏度的检测方式，为微生物检测技术的发展提供了新的思路。

该研究还强调了纳米材料与生物分子结合的重要性。MWCNTs作为电化学传感器的基底材料，不仅能够提高电荷转移效率，还能提供更大的比表面积，从而增强传感器对目标分子的捕获能力。通过电沉积技术，研究人员成功地将MWCNTs固定在电极表面，并进一步通过EDC/NHS化学偶联方法将T-PTA结合到该基底上。这种共价偶联方式确保了抗菌肽在传感器表面的稳定性和持久性，避免了物理吸附可能带来的脱附问题。同时，结合了非共价作用的疏水性相互作用，进一步增强了T-PTA与细菌表面的结合能力。

此外，研究还探讨了抗菌肽在微生物检测中的机制。T-PTA的亲脂性结构使其能够选择性地结合到细菌细胞膜上，而其正电荷则促进了与带负电荷的微生物表面的相互作用。这种静电吸引和结构特异性结合的双重机制，使得T-PTA能够高效地识别并结合目标细菌，从而引发显著的电化学信号变化。这种结合方式不仅提高了传感器的灵敏度，还增强了其选择性，使其能够在混合样本中准确识别特定菌种。

该研究还提到，尽管AMPs在抗菌方面表现出广泛的活性，但其与不同细菌的相互作用仍受到细菌表面组成的影响。例如，革兰氏阴性菌由于其外膜中的LPS含量较高，表现出更强的电化学响应，而革兰氏阳性菌由于其厚壁的肽聚糖结构，与传感器的结合较为有限。因此，传感器的性能不仅依赖于抗菌肽的特性，还与目标微生物的表面结构密切相关。这一发现为后续的传感器优化提供了理论依据，即可以通过调整抗菌肽的结构或传感器表面的化学修饰，进一步提高其对特定细菌的识别能力。

从技术发展角度来看，这项研究代表了生物传感技术的一个重要进展。传统的微生物检测方法往往需要较长的培养时间，而电化学传感器则能够在短时间内提供结果，这对临床诊断和公共卫生监测具有重要意义。此外，该传感器的构建方法具有良好的可扩展性，能够适用于不同类型的微生物检测，包括病原菌、共生菌和环境微生物等。未来，随着纳米材料和生物分子的进一步优化，这类传感器有望在更广泛的领域中发挥作用，例如食品安全检测、环境监测和个性化医疗等领域。

最后，研究团队对所使用的材料和实验条件进行了详细的描述，确保实验的可重复性和科学性。所有实验均在标准条件下进行，并使用高纯度的抗菌肽和纳米材料，以减少实验误差。同时，实验数据通过多种分析方法进行了交叉验证，确保了结果的准确性和可靠性。这种严谨的实验设计和全面的性能评估，为该传感器的实际应用提供了坚实的科学基础。未来，随着相关技术的不断进步，这种基于抗菌肽的电化学传感器有望成为微生物检测领域的重要工具，为公共健康和生物医学研究带来新的突破。