拟南芥磷脂:二酰甘油酰基转移酶1(AtPDAT1)表达水平的定量蛋白质组学分析揭示其在植物应激反应和脂质代谢中的关键作用

本研究通过定量蛋白质组学技术，深入探讨了拟南芥中磷脂:二酰甘油酰基转移酶1(PDAT1)表达水平变化对植物生理的广泛影响。研究人员发现，AtPDAT1过表达株系虽未增加三酰甘油(TAG)积累，但显著提升了植物活力、生长速率及抗寒性，并揭示了其在脂质代谢、光保护、自噬及应激反应中的关键调控作用。该研究为作物抗逆育种提供了新的分子靶点，具有重要的理论价值和农业应用前景。

　　

在植物生物学领域，提高作物的抗逆性和产量一直是科学家们追求的目标。三酰甘油(TAG)作为植物中主要的能量储备和碳源，其生物合成途径中的关键酶一直备受关注。除了众所周知的酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(DGAT)之外，磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT)提供了另一条TAG合成的替代路径。早期在酵母中的研究曾令人振奋，显示PDAT过表达能使TAG积累增加高达150%，这燃起了通过基因工程创造高油分作物新品种的希望。然而，当科学家们将AtPDAT1基因在模式植物拟南芥中过表达后，却惊讶地发现这些转基因植株并没有如预期那样积累更多的TAG。更令人困惑的是，这些植株却表现出生长加速、种子产量提高，以及在冷胁迫条件下更强的耐寒性。相反，敲除PDAT1基因的植株则比野生型更为敏感。这种表型与代谢产物变化的不匹配暗示着PDAT1可能扮演着比先前认知更为复杂的角色，远不止于简单的TAG合成酶。为了揭开这个谜团，Pirog等研究人员在《BMC Genomics》上发表了他们的最新研究成果，通过定量蛋白质组学技术深入探索了AtPDAT1表达水平变化所引起的广泛细胞变化。

研究人员主要采用了基于质谱的定量蛋白质组学技术，包括数据非依赖采集(DIA)和数据依赖采集(DDA)策略。他们使用了拟南芥野生型(哥伦比亚生态型)、两个AtPDAT1过表达株系(OE1和OE2)和一个T-DNA插入敲除株系(SALK_032261)的叶片组织，每种基因型包含5个生物学重复。样本经过玻璃珠均质化、丙酮/三氯乙酸沉淀、尿素提取和胰蛋白酶消化后，通过高pH反相色谱进行肽段分级。液相色谱-质谱联用分析在Orbitrap Exploris 480质谱仪上进行，采用Thermo Scientific RSLC 3000纳升液相系统。蛋白质鉴定使用MSFragger搜索拟南芥UniProt数据库，定量则采用DIANN软件和MaxLFQ算法。统计学分析包括Welch检验、ANOVA和 permutation-based FDR校正，定义显著变化的蛋白质需满足fold change>2且q<0.01。基因本体(GO)分析使用定制Python脚本进行。此外，还通过乙醇提取和分光光度法测定了叶片脯氨酸含量。

结果

数据质量

研究成功建立了高度可重复的植物叶片蛋白质组学分析方法，共定量到6023个蛋白质组，其中5196个没有任何缺失值，为分析低丰度蛋白质提供了机会。

蛋白质定量结果

两个AtPDAT1过表达株系几乎 identical(图1C)，确保了观察到的效应确实是AtPDAT1过表达的结果而非脱靶效应。过表达株系中观察到247个显著调控的蛋白质组，而敲除株系中只有118个，且变化幅度较小(图1D)。大多数变化与脂质代谢无直接关系，表明AtPDAT1过表达影响了更广泛的生理过程。

基因本体分析

GO分析显示，AtPDAT1过表达的影响远强于敲除突变(图2)。过表达株系中，与应激反应相关的过程和活动明显受影响，同时还影响了植物细胞壁生物合成和维持以及质体小球内容物等相关术语。

加权平均分析显示(图3)，最受影响的过程与应激反应或植物生长和发育调控相关。

讨论

研究发现AtPDAT1过表达显著影响了整个植物蛋白质组。虽然叶片不是TAG积累的特化组织，但PDAT酶在光合组织中的重要性被认为与膜脂(磷脂)重塑有关，这对于维持膜稳态、适当结构和流动性以及隔离有毒脂质中间体至关重要。研究表明，AtPDAT1过表达影响了质体小球及其相关酶的生产，正向影响了参与应激反应、光保护和自噬的蛋白质水平。

研究检测到糖转运蛋白ERD6-like 4水平显著升高，支持了脂肪酸通过TAG池β-氧化释放的乙酰辅酶A产生苹果酸，再通过乙醛酸循环和糖异生转化为糖的假设，这可能是过表达株系生长增强的解释之一。

脂质代谢增强的证据还包括丙二酸单酰辅酶A连接酶水平的增加，该酶产生用于脂肪酸从头合成和延伸的前体丙二酸单酰辅酶A。

在测试的过表达株系中，检测到几种质体小球蛋白质组分的水平增加：NDC1(替代NAD(P)H-泛醌氧化还原酶C1)、CCD4(推定的类胡萝卜素裂解双加氧酶4)、ABC1K3(蛋白激酶3活性)、VTE1(生育酚环酶)以及两个具有甲基转移酶11结构域的蛋白质。这些蛋白质与质体醌(PQ)代谢、α-生育酚生物合成和类胡萝卜素代谢有关，PQ在非光化学淬灭中起重要作用，具有清除活性氧的强大抗氧化活性。通过Violaxanthin de-epoxidase(VDE)水平升高也增强了光保护机制，这可能有助于过表达株系更高的种子生产力和植物生物量。

研究证实了先前观察到的自噬过程相关蛋白ATG8水平升高，并进一步揭示了另一个货物受体ATI1(ATG8-interacting protein 1)水平更高，该蛋白直接参与质体和内质网的自噬降解过程。脂质和自噬过程似乎相互促进，驱动彼此以及与脂质代谢相关的其他过程。

这些机制可能负责确保更好的适应性和对非生物胁迫的防护。相反，参与生物胁迫反应的过程被下调。特别是，磷酸肌醇磷脂酶C1(植物胁迫信号中的重要蛋白)水平显著下降。SUPPRESSOR OF NPR1-1 CONSTITUTIVE 4(SNC1)水平升高，导致PR蛋白(病原相关thaumatin超家族蛋白、内切几丁质酶、Defensin-like protein 2和196)水平降低，表明AtPDAT1过表达株系中对病原体防御反应机制被削弱。

AtPDAT1过表达还影响了与脂质或PDAT活性无关的蛋白质水平，如参与植物细胞壁多糖生物合成、修饰和降解的酶，这可能影响细胞壁弹性和水合作用，从而影响植物形态和生长能力。过表达株系中Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)水平降低，可能是由于光保护、自噬或利用磷脂中氧化酰基的PDAT活性等其他过程的足够效率。

此外，在AtPDAT1过表达植物中观察到硫代葡萄糖酸盐代谢途径的转变：Epithiospecifier protein(ESP)表达严重上调，同时GDSL酯酶/脂肪酶ESM1表达下调，导致毒性较低的腈类产生，可能降低植物自身的负担。

对于敲除株系，没有检测到像过表达株系那样多的蛋白质水平变化。除了确认编码PDAT酶的基因被有效敲除外，研究检测到几种与植物适应特别是低温胁迫相关的蛋白质水平降低：低温诱导65 kDa和78 kDa蛋白(LTI65; LTI78)、晚期胚胎发生丰富蛋白7(LEA7)、应激诱导蛋白KIN1和KIN2、冷调节15 A蛋白(COR15)。这一结果与先前观察到的pdat1株系在4°C体外培养条件下的矮化表型相关。另一方面，pdat1敲除显示富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白PCC1(病原体和昼夜节律控制1)水平显著增加，该蛋白是对不同病原体防御反应的调节剂，表明AtPDAT1下调可能增强生物胁迫反应，与AtPDAT1过表达株系相反。过表达株系和敲除株系在Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase A(P5CSA)水平上也存在显著差异，该酶参与脯氨酸(一种渗透保护化合物)的生物合成，但在脯氨酸含量分析中未发现显著差异。

结论

该研究结果表明，参与三酰甘油生物合成的一个基因AtPDAT1的过表达显著改变了拟南芥的蛋白质组。令人惊讶的是，AtPDAT1水平的增加比其完全缺失产生更明显的表型。过表达强烈影响依赖和不依赖脂质代谢的蛋白质水平。由AtPDAT1过表达引起的膜脂代谢相关过程的变化表明，其升高的转换可能与光保护、自噬和应激反应等过程相关。这些过程为植物提供了增强的活力和适应性，表明通过改善这些被称为"脂质相关应激蛋白"的蛋白质组，植物对非生物胁迫刺激的敏感性降低。涉及适应和应激反应的其他过程似乎不那么突出，主要是参与植物对生物胁迫反应的蛋白质水平被下调。同时，pdat1株系的蛋白质组学分析并未揭示像过表达那样广泛的蛋白质变化。与过表达株系相反，pdat1株系的特点是参与生物胁迫反应的蛋白质积累增加，而参与非生物胁迫反应的蛋白质减少。该研究还详细提供了简单且可重复的植物叶片蛋白质组学分析方法，以增强蛋白质组学研究植物样本制备的有效性。这些发现不仅深化了对PDAT1生物学功能的理解，而且为作物抗逆育种提供了新的策略和靶点。