Acinetobacter baylyi ADP1中香草酸脱甲基酶VanAB对丁香酸转化及升级为聚酯前体PDC的新发现

本研究针对木质素衍生芳香化合物生物升级的挑战，探索了Acinetobacter baylyi ADP1中香草酸脱甲基酶VanAB对S-木质素相关丁香酸的转化机制。通过体内外实验证实VanAB具有先前未知的O-脱甲基化活性，可高效将丁香酸转化为3-O-甲基没食子酸(3MGA)和没食子酸。通过调控vanAB表达水平并异源表达galA基因，成功将中间产物3MGA转化为高价值聚酯前体2-吡喃酮-4,6-二羧酸(PDC)，为木质素生物炼制提供了新策略。

　　

随着化石资源日益枯竭和环境问题加剧，开发可再生生物质资源已成为全球关注的焦点。木质素作为植物细胞壁的主要组成部分，是自然界中最丰富的芳香聚合物，占木质纤维素生物量的三分之一。这种复杂的聚合物由三种主要亚基——对羟基苯基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基(S)单元——通过错综复杂的网络连接而成。虽然木质素为植物提供保护和支持，但在以木质纤维素为原料的工业中却常被视为麻烦，主要被焚烧用于发电。如果能将木质素升级为高价值产品，将显著提高生物基产业的经济可行性，并促进资源的碳智慧利用。

然而，木质素生物升级面临重大挑战。解聚后的木质素是由多种芳香化合物组成的异质混合物，其组成因植物类型而异。特别是S-木质素衍生的芳香化合物（如丁香醛和丁香酸）在硬木和禾本科植物中含量丰富，但能够代谢这些化合物的微生物菌株十分稀缺。这些化合物的难点在于其芳香环上连接有两个甲氧基，相比只有一个甲氧基的G-木质素和没有甲氧基的H-木质素，它们的代谢需要更多的O-脱甲基化步骤，这对微生物提出了更高要求。

在好氧微生物中，O-脱甲基化由三类酶催化：Rieske加氧酶(RO)、细胞色素P450(P450s)和四氢叶酸(THF)依赖性脱甲基酶。其中Rieske加氧酶如VanAB使用NAD(P)H作为辅因子，将甲基氧化为甲醛，这一过程不仅消耗大量能量，还会产生对细胞有毒的甲醛。因此，开发能够高效处理S-木质素衍生化合物且能应对这些挑战的微生物平台至关重要。

Acinetobacter baylyi ADP1(ADP1)作为一种极具潜力的微生物细胞工厂，因其 versatile 代谢和天然感受态而受到越来越多关注。ADP1能够通过各种天然β-酮己二酸途径利用G型和H型木质素单体，并已被证明对软木具有木质素降解效果。先前研究已经成功改造ADP1，使其能够从木质素相关芳香化合物（如阿魏酸和对香豆酸）生产蜡酯、烷烃、1-烯烃、顺,顺-粘康酸、甲羟戊酸、柚皮素、白藜芦醇和香草醛葡萄糖苷等产品。

尽管ADP1在利用木质素相关芳香化合物方面显示出巨大潜力，但其VanAB酶对S-木质素衍生芳香化合物的O-脱甲基化活性此前未被发现。Tuomela等人在《Microbial Cell Factories》发表的研究旨在探索ADP1中VanAB对丁香酸的转化能力，并开发将其升级为有价值产品的策略。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过同源重组和反选择技术构建基因缺失和回补菌株；利用组成型和诱导型表达系统进行基因表达调控；通过高效液相色谱(HPLC)分析代谢物；使用镍亲和层析纯酶蛋白；通过酶活性测定分析底物特异性；在生物反应器中进行补料分批培养优化生产过程。

Conversion and upgrading of syringate by Acinetobacter baylyi ADP1

研究人员首先通过删除基因组中的天然vanAB拷贝构建了ASA1002菌株，并将两个基于质粒的过表达系统(pBAV1C-T5-vanAB和pBAV1Cd-chn-vanAB)转入ASA1002，获得了组成型(ASA1003)和环己酮诱导型(ASA1004)表达vanAB的菌株。这些菌株在以香草酸为唯一碳源的培养基中生长实验表明，vanAB的过表达导致近10小时的延滞期，而ADP1野生型则没有明显延滞期。

Characterization of the growth and conversion of vanillate and syringate by VanAB expressing strains

研究人员测试了ADP1野生型和工程菌株对丁香酸的耐受性。培养基中添加了50 mM葡萄糖和0-20 mM丁香酸。在最高浓度(20 mM)下，菌株ADP1 WT、ASA1002和ASA1003均有约6小时的延滞期，而诱导的ASA1004菌株延滞期更长(约12小时)。所有菌株中，丁香酸都对生长产生负面影响，且诱导的ASA1004即使在低丁香酸浓度下生长也受到阻碍。

Syringate and 3 MGA conversion by VanAB in wild-type and engineered ADP1

基于耐受性测试，研究人员选择5 mM浓度研究ADP1体内丁香酸转化。他们发现ADP1野生型在24小时内将丁香酸和3MGA完全O-脱甲基化，而P. putida KT2440仅将少量丁香酸转化为3MGA。工程菌株ASA1003和ASA1004(过表达vanAB)表现出与ADP1野生型不同的反应动力学——同时进行丁香酸和3MGA的O-脱甲基化，而非野生型中的顺序进行。

VanAB activity in vitro

为了研究VanAB的底物偏好性，研究人员从ASA1004培养物中纯化了VanAB进行酶活性测定。结果显示VanAB对香草酸和丁香酸的米氏常数(K_M)分别为42±15μM和38±9μM，表明丁香酸与香草酸同样是良好的底物。然而，在研究的条件下未能检测到VanAB对3MGA的体外活性，尽管在体内培养中观察到了VanAB介导的3MGA O-脱甲基化。

Production of PDC in ADP1

研究人员探索了将丁香酸通过3MGA和没食子酸两条已知途径转化为PDC的策略。通过引入来自P. putida KT2440的没食子酸双加氧酶galA，成功在ADP1中展示了从丁香酸生产PDC的能力，摩尔转化率约为0.38 mol_PDC/mol_syringate。在生物反应器培养中，通过共供给香草酸和丁香酸，有效改善了PDC生产，产量达到0.19 mol_PDC/mol_syringate。

研究结论表明，ADP1中的香草酸O-脱甲基酶VanAB具有先前未知的丁香酸和3MGA转化活性。通过调整vanAB的表达水平，可以将丁香酸导向没食子酸或3MGA，后者可通过异源表达galA进一步转化为PDC。这些发现扩展了ADP1的芳香底物范围，使其能够包括S-木质素衍生的芳香化合物，进一步促进了该宿主在木质素相关化合物生物升级中的应用。

讨论部分强调，这项研究不仅揭示了一个先前未知的酶活性，还开发了一种将木质素衍生化合物升级为高价值生物塑料前体的策略。通过共供给策略平衡代谢流，减少了有毒副产物的积累，提高了过程效率。该研究为开发更高效的木质素生物精炼平台奠定了基础，推动了可再生资源向可持续化学品的转化。