在Scedosporium apiospermum中优化CRISPR-Cas9基因编辑技术

《Mycopathologia》：Optimization of the Genome Editing CRISPR-Cas9 Technology in Scedosporium apiospermum

CRISPR-Cas9技术优化用于Scedosporium真菌基因敲除，通过敲除KU70基因抑制非同源重组，使用双RNA引导Cas9复合体和链霉素抗性修复模板成功中断4个双加氧酶基因，效率达20%，为多基因敲除和互补实验奠定基础。

　　

摘要

Scedosporium属真菌是机会性病原体，可引发多种人类感染。迄今为止，关于这些真菌的致病机制的信息仍然有限，部分原因是可用的遗传工具数量有限。本文中，我们利用CRISPR-Cas9技术（该技术在丝状真菌的功能基因组研究中取得了令人满意的结果）对Scedosporium属真菌进行了优化，具体是通过体外组装的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物来实现的。在这些真菌中，由于非同源重组的高发频率，野生型菌株的功能基因组研究尤为复杂。在进行研究之前，需要先破坏编码非同源末端连接系统组件的KU70基因，这需要使用第一个选择标记。利用双RNA引导的Cas9复合物在目标基因两端进行切割，随后与含有潮霉素抗性基因的修复模板进行重组，从而在ΔKU70突变体中实现目标基因的破坏。成功破坏了四个编码双加氧酶的基因，这些双加氧酶参与芳香烃的关键环开环反应；使用5微克的HygR修复盒时，实验效率达到最佳。另外，在野生型菌株中，仅使用两个Cas9 RNP复合物就足以实现高效的基因删除；在获得的菌落中，有高达20%的菌落中成功删除了一个双加氧酶基因。这些实验条件为多重基因删除和互补实验奠定了基础，而使用我们最初的程序无法实现这些实验，因为Scedosporium属真菌仅有两个选择标记。