HiFi测序揭密DNA复制时核小体如何重新填充染色质纤维

2025年1月9日，来自美国加州大学旧金山分校的Vijay Ramani团队在Cell上发表文章，提出了一种基于PacBio HiFi长读长测序技术的复制感知的单分子可及性图谱技术，该技术能全面、无损地观察新生染色质纤维上的蛋白质-DNA相互作用。

新复制染色质的单分子可及性图谱 

核小体是表观遗传的关键。形成核小体的组蛋白-DNA相互作用在DNA复制过程中被破坏，然后通过组蛋白再循环和在复制叉后重新沉积组蛋白的混合方式迅速重组。对新复制染色质结构的认识一开始是通过生化实验，但其具有破坏性，无法进一步增进了解。于是出现了新生DNA的经典核苷酸模拟标记与高通量测序相结合的基因组学方法，进一步提高了分辨率。但受到Illumina测序技术的限制，无法连续地捕捉单个分子上蛋白质与DNA的相互作用，从而限制了对DNA复制时核小体如何重新填充染色质纤维的理解。

2025年1月9日，来自美国加州大学旧金山分校的Vijay Ramani团队在Cell上发表了题为“The single-molecule accessibility landscape of newly replicated mammalian chromatin”的文章，提出了一种基于PacBio HiFi长读长测序技术的复制感知的单分子可及性图谱技术（replication-aware single-molecule accessibility mapping, RASAM），该技术能全面、无损地观察新生染色质纤维上的蛋白质-DNA相互作用。基于RASAM，研究人员发现了新复制染色质的独特组织结构，揭示了单分子层面上转录因子（TF）与核小体之间对调控DNA的竞争。

结果与讨论 

RASAM

为实现RASAM，需先证明PacBio HiFi长读长测序技术可用于检测核苷酸类似物溴脱氧尿苷（BrdU）。于是，研究人员训练了一个预测模型（卷积神经网络，CNN），利用PacBio测序*检测修饰的核苷酸（m6dA，BrdU），并利用模型进行量化（图 1A，BrdU反映新复制的染色质，m6dA反映染色质可及性）。经验证，测序数据预测结果与液相色谱-质谱法（LC-MS）结果一致，在长标记时间内，人K562 DNA含有BrdU的比例高于小鼠mESC。并且，BrdU（+）分子和未标记分子的测序读长分布和甲基化分布结果都高度一致。这些结果表明，PacBio测序技术可以同时检测长DNA分子的BrdU掺入和染色质可及性，即RASAM。

图 1. PacBio HiFi测序可以同时检测BrdUTP掺入和m6dA标记的哺乳动物细胞单DNA分子的的染色质可及性

*研究人员进行了一系列实验，将人（K562细胞）或小鼠（E14 mES胚胎干细胞）培养在含BrdU的培养基中，基于DNA足迹法使用高活性非特异性腺嘌呤甲基转移酶EcoGII对细胞进行标记，然后在Sequel II平台上进行PacBio HiFi测序。

哺乳动物染色质纤维在复制后具有高度可及性

研究人员通过K562细胞的四个不同标记时间点（10 min、2、6 和 24 h，28.1 Gb）和E14 mESCs 的六个不同标记时间点（5、10 min、1、6、12 和 24 h，78.1 Gb）评估分叉后不久的新生染色质结构和染色质的成熟度。计算每个测序样本中BrdU（+）和未标记分子之间平均染色质可及性折叠变化（图2A）发现：在早期标记时，BrdU(+)纤维最有可能代表新生染色质，观察到较高的可及性折叠变化：BrdU标记10 min后，K562s和mESCs中可及性折叠变化分别为37.6%和23.2%，且可重复（图2B和2C）。在标记时间长到接近各自细胞周期长度的情况下，BrdU（+）纤维的平均可及性与稳态纤维的可及性非常接近（在24 h K562实验中，分别为3.32%和3.49%；在12 h E14实验中，分别为2.62%和0.346%）。脉冲追踪（pulse - chase）RASAM实验也证实了染色质可及性的增加及其随时间变化的分辨率（图2E和2F）。基于此，研究人员将这种单分子可及性增加的现象称为 “新生染色质超可及性”。

图2. RASAM揭示了新复制的哺乳动物染色质纤维上的单分子DNA超可及性

新生染色质纤维迅速重塑并富含无序核糖体阵列

为了确定新生染色质上的单分子核小体模式，研究人员分析了RASAM数据的单分子核小体的重复长度（NRL）和规则性（图3A）发现即使在标记10 min后，BrdU（+）纤维的第一个千碱基DNA中具有规则间隔核小体的比例也很高（K562为66.5%；mESC为69.0%），表明染色质纤维在复制后迅速被均匀分布的核小体填充。接着，对每种纤维类型（K562的7种和mESC的5种不同纤维类型；图3D和3E，左）和标记时间（图3D和3E，右）进行了统计意义上的显著富集分析，表明哺乳动物的新生染色质纤维富含较长的NRL和不规则、无序的核小体阵列。并且通过计算每个分子的可及性与AT核苷酸含量之间的相关性证明与成熟纤维上的核小体相比，不规则新生纤维上的核小体位置更受DNA一级序列的限制。

图3. 新生和成熟染色质中单分子核小体间距的全局分析。

由于长读长HiFi技术可对短读长“不可映射”区域进行全面检测，进一步分析了表观基因组范围内的新生染色质的可及性，发现新生染色质的高可及性是基因组的一个普遍特征，包括存在于卫星、端粒和rDNA序列中的基因位点（Illumina测序较难覆盖），而且很可能与复制时间无关。

新生染色质超可及性的调控机制

研究人员发现复制后的全基因组单分子''超可及性''状态会在几个小时内消失：结合RASAM和蛋白质快速降解的细胞模型，研究人员证明组蛋白伴侣CAF-1通过填补单分子''间隙''并在复制的DNA上生成均匀分布且紧密间隔的核糖体阵列，降低了新生染色质的可及性（图4）。

对于顺式调控元件，在CCCTC结合因子（CTCF）结合位点上，CTCF与核小体竞争，从而降低了复制后CTCF的占据率和基序可及性（图5C）；活跃的转录起始位点TSS则在复制后立即保持单分子状态分布，染色质的高可及性得以维持（图5D）。

图4. 组蛋白伴侣CAF-1的缺失破坏了复制叉后面的单分子染色质景观。

图5. 新生染色质纤维上的CTCF基序模式和TSS可及性。

讨论与建议 

该研究介绍的RASAM是一种HiFi长读长测序方法，它能以单分子和近核苷酸分辨率测量哺乳动物新生染色质的可及性。通过在mESCs和人类K562细胞中应用RASAM，研究人员观察到了新生染色质超可及性的现象，这是一种瞬时的单分子染色质状态，经过几个小时的染色质成熟后，这种瞬时的单分子染色质状态会逐渐消失，从而产生稳态的易可及性模式。详见研究人员提出的复制叉后染色质成熟的 “调控 ”模型（图 6）。

图6. 新生染色质纤维成熟模型。

参考文献：Ostrowski, Megan S. et al.(2024), The single-molecule accessibility landscape of newly replicated mammalian chromatin. Cell, Volume 188, Issue 1, 237 - 252.e19. DOI: 10.1016/j.cell.2024.10.039

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