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蛋白质的分子相互作用和翻译后修饰（PTMs）相互关联，却缺乏同时研究二者的系统方法。研究人员开发 SEC-MX 方法，结合尺寸排阻色谱和 PTM 富集技术。该方法能同时表征 PTMs 和组装状态，揭示了二者的复杂关系，为探索蛋白质功能和调控提供了新工具。
在生命科学领域，蛋白质就像一个个精密的小机器，它们的行为和功能影响着细胞的方方面面。蛋白质的分子相互作用和翻译后修饰（Post-translational modifications，PTMs），比如磷酸化，对细胞的正常运作至关重要。这两者之间存在着相互依赖、相互调控的关系，就像两个配合默契的舞者，共同演绎着细胞内复杂的生命活动。然而，一直以来，科学家们都缺少一种系统的方法，能从同一样本中同时研究蛋白质的组装状态和 PTMs，这就好比在黑暗中摸索，难以全面了解蛋白质的奥秘。
为了打破这一困境，来自哥伦比亚大学（Columbia University）的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们致力于开发一种新的技术方法，来深入探究蛋白质组装状态与磷酸化之间的关系。经过不懈努力，研究人员成功开发出 SEC-MX（Size Exclusion Chromatography fractions MultipleXed）技术，这一成果发表在《Nature Communications》上，引起了科学界的广泛关注。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC），它能根据蛋白质组装体的分子量大小，将不同组装状态的蛋白质分离开来。接着，利用串联质谱标签（Tandem mass tags，TMTpro）对 SEC 分离出的组分进行标记和多重化处理，大大提高了样本的处理效率。之后，通过固定化金属亲和色谱（Immobilized metal affinity chromatography，IMAC）进行磷酸肽富集，使得研究人员能够对磷酸化修饰进行深入分析。最后，结合液相色谱 - 串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术对样品进行检测，并运用一系列数据分析方法挖掘其中的关键信息。
下面来详细看看研究结果：
- SEC-MX 的开发与验证：研究人员开发的 SEC-MX 技术，通过标记和多重化 SEC 组分，不仅减少了构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein-protein interactions，PPIs）网络所需的 LC-MS/MS 运行次数，还能进行磷酸肽富集。与当前的金标准无标记 SEC 结合数据独立采集（Data independent acquisition，DIA）技术（SEC-DIA）相比，SEC-MX 在蛋白质鉴定和定量方面表现相当，但测量时间大大缩短。
- SEC-MX 实现磷酸肽富集：研究人员利用 SEC-MX 技术，从人胚肾细胞系 HEK293 和人结肠癌细胞系 HCT116 中收集了大量数据。结果显示，该技术能有效富集磷酸肽，生成了包含约 4600 个磷酸肽及其匹配的亲本蛋白质的数据集，为后续研究奠定了坚实基础。
- 以蛋白质为中心的分析框架：研究人员基于 SEC 数据，通过峰识别算法确定蛋白质的组装状态。他们发现，超过一半的测量蛋白质存在两种或更多的组装状态，且磷酸化往往发生在蛋白质的组装形式上。这一发现表明，蛋白质的组装状态和磷酸化之间存在着紧密的联系。
- PTM 映射到组装状态：通过将磷酸化位点映射到单个组装状态，研究人员发现不同蛋白质的磷酸化模式差异很大。例如，非肌肉肌球蛋白 IIA（Myosin-9，MYH9）的磷酸化在其多聚体和单体组装状态下存在差异；RNA 结合蛋白 PTBP1 的磷酸化只发生在低分子量的组装状态，且可能与 RNA 结合调控有关；DNA 复制许可因子 MCM3 的不同磷酸化位点与不同的组装状态相关。这些结果揭示了蛋白质组装状态和磷酸化之间复杂的相互关系。
- SEC-MX 实现生物样品间的差异比较：研究人员对比了 HEK293 和 HCT116 细胞系的蛋白质组装状态和磷酸化情况，发现两种细胞系之间存在一些差异。例如，SEC-MX 检测到 Hsp90 辅伴侣 Cdc37（CDC37）与 HSP90 伴侣的结合模式在两种细胞系中不同，这可能与 HCT116 细胞的癌症起源有关。此外，通过与 BioPlex 研究结果对比，SEC-MX 在检测蛋白质组装状态差异方面具有独特优势。
- 组装状态分辨率揭示差异分析：研究人员通过比较不同条件下蛋白质组装状态的峰比值和总丰度比值，发现 SEC-MX 能够提供比传统丰度测量更细致的蛋白质功能调控信息。以细胞周期调节因子 CDK4 和 mTOR 调节相关蛋白 RPTOR 为例，SEC-MX 揭示了它们在不同组装状态下的磷酸化差异，为深入理解蛋白质功能提供了新视角。
- 利用 SEC-MX 探索功能通路：研究人员通过比较 HCT116/HEK293 在磷酸化和非磷酸化样品中的峰比值，对蛋白质进行分类，并进行通路富集分析。结果发现，不同的响应组对应不同的功能通路和激酶靶点。例如，HEK293 细胞中磷酸化增加的蛋白质与 p53 相关通路和 ATR、ATM 激酶靶点富集有关；HCT116 细胞中磷酸化的组装状态与 mTORC1 介导的信号通路和 RPS6KB1、mTOR 激酶靶点富集有关。这表明 SEC-MX 能够帮助研究人员深入了解细胞内的信号通路调控机制。
综上所述，SEC-MX 技术为研究蛋白质调控和细胞功能提供了一个强大的平台。它不仅能够同时表征蛋白质的翻译后修饰和组装状态，还能深入探究两者之间的相互作用。通过对 HEK293 和 HCT116 细胞系的研究，研究人员揭示了蛋白质组装状态和磷酸化之间的复杂关系，为后续研究提供了许多可测试的假设。虽然 SEC-MX 技术目前还存在一些局限性，如依赖 TMT 等昂贵的标记试剂、可能存在数据压缩和缺失等问题，但它仍然为蛋白质组学研究开辟了新的道路。未来，随着技术的不断改进和完善，SEC-MX 有望在生命科学领域发挥更大的作用，帮助科学家们更深入地理解蛋白质的奥秘，为攻克各种疾病提供新的思路和方法。
