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在传染病诊断领域，CRISPR 技术潜力巨大，但引物和 gRNA 设计困难重重。为此，研究人员开展 PathoGD 相关研究。他们开发出自动化生物信息学流程，设计出高特异性引物和 gRNA，实验验证效果良好。这为传染病诊断提供新途径，助力防控工作。
在传染病的防控战场上，快速且精准的诊断就像一把关键的钥匙，能有效阻止疾病的传播。传统的诊断方法，比如聚合酶链反应（PCR），就像被束缚在实验室里的 “巨人”，依赖专业人员和昂贵设备，难以广泛应用。近年来，CRISPR 技术异军突起，凭借其简单、特异性高、无需复杂设备的优势，在传染病诊断领域掀起了热潮。它就像一把精准的 “分子剪刀”，能准确识别病原体的核酸，被广泛用于检测各类病毒、细菌和寄生虫。
然而，CRISPR 诊断想要大显身手，还面临着一个关键挑战 —— 如何设计出高度敏感且特异性强的引物和向导 RNA（gRNA）。目前的设计过程复杂又繁琐，需要反复进行人工筛选、优化和重新设计，不仅耗时费力，还可能无法充分捕捉病原体的遗传多样性，导致诊断失误。而且，现有的 gRNA 设计工具大多是为基因组编辑 “量身定制” 的，并不完全适用于 CRISPR 诊断。因此，开发一款专门针对核酸检测、自动化且可扩展的引物和 gRNA 设计工具迫在眉睫。
为了解决这些难题，来自澳大利亚墨尔本大学（The University of Melbourne）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一项关于开发生物信息学流程 PathoGD 的研究，旨在实现基于 CRISPR - Cas12a 病原体检测的重组酶聚合酶扩增（RPA）引物和 gRNA 的高通量快速设计。经过不懈努力，他们成功开发出 PathoGD。这一成果意义重大，为传染病诊断的引物和 gRNA 设计提供了新的有力工具，有望推动传染病诊断技术的发展。相关研究成果发表在《Communications Biology》上。
研究人员在开展研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：
- 泛基因组分析：利用 Prokka 和 Roary 软件对目标基因组进行注释和泛基因组估计，找出保守基因作为潜在靶点，再通过一系列比对和筛选步骤设计引物和 gRNA。
- k - mer 分析：借助 GenomeTester4 软件对目标和非目标基因组进行 k - mer 枚举和比较，去除可能存在交叉反应的序列，筛选出特异性 k - mer，进而设计引物和 gRNA。
- 体外验证：通过 RPA - CRISPR - Cas12a 实验，对设计的引物和 gRNA 进行体外验证，检测其对目标病原体的检测能力和特异性。
下面让我们详细了解一下研究结果：
- PathoGD 流程概述：PathoGD 是一款用 Bash 和 R 语言编写的自动化命令行工具，整合了多种生物信息学工具的功能。它包含泛基因组和 k - mer 两个模块，用户可根据偏好选择。运行时，用户输入模块和工作流程选择以及配置文件，就能自动完成引物和 gRNA 设计，输出结果包含多种信息，方便用户进一步筛选。
- PathoGD 泛基因组和 k - mer 模块：
- 泛基因组模块：先找出目标基因组中高度保守（在 90% 以上目标基因组中存在）的蛋白质编码基因，与非目标基因组的蛋白质序列聚类，排除可能导致交叉反应的基因。然后在剩余基因中寻找规范的 TTTN PAM 位点，确定潜在 gRNA 序列，再通过序列比较去除与非目标基因组匹配的 gRNA，最后设计引物并进行虚拟 PCR 评估。
- k - mer 模块：对目标和非目标基因组进行 k - mer 枚举，去除与非目标基因组有相似序列（允许最多两个错配）的 k - mer，再次枚举筛选出目标特异性且位于 PAM 位点下游、符合基因组流行度阈值的 k - mer 作为潜在 gRNA。同样去除可能形成发夹结构的 gRNA，设计引物并进行虚拟 PCR 评估。该模块还能识别基因组中的多拷贝序列，这些序列可作为潜在诊断靶点。
- 最小化潜在脱靶活性：PathoGD 通过多步筛选，在序列层面减少脱靶可能性。比如在泛基因组模块中，排除与非目标物种相似的核心基因，通过 k - mer 比较去除与非目标或人类基因组数据库错配少于三个的候选 gRNA。同时，在输出结果中提供多种信息，帮助用户权衡引物和 gRNA 组合的敏感性和特异性，选择更可靠的组合。
- PathoGD 对五种临床相关人类病原体引物和 gRNA 设计的计算性能：研究人员用 PathoGD 为五种全球重要病原体设计引物和 gRNA，涵盖革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。设计过程使用了 NCBI 数据库中的基因组，运行时间因数据库大小而异，最长为 5 小时 26 分钟，大部分在 4 小时内完成。研究还找出了流程的瓶颈阶段，并通过使用高效算法工具提高了计算性能。
- 使用 PathoGD 鉴定引物和 gRNA：PathoGD 鉴定出的目标特异性 gRNA 数量在不同物种间差异较大，与基因组大小、核心基因变异等因素有关。泛基因组和 k - mer 模块鉴定出的 gRNA 部分重叠，二者具有互补性。k - mer 模块还能识别多拷贝 gRNA，虽找到的保守引物结合位点有限，但在低病原体丰度样本检测中具有潜在优势。
- PathoGD 与 PrimedSherlock 的比较：以黄病毒属的几种病毒为例，研究人员用 PathoGD 的 k - mer 模块设计引物和 gRNA，并与 PrimedSherlock 的结果对比。发现 PathoGD 设计的 gRNA 在目标基因组中的流行度和保守性相当或更高，且二者设计结果重叠较少，体现了不同设计方法的差异。
- 引物和向导 RNA 的实验验证：研究人员对化脓性链球菌（S. pyogenes）和淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae）的引物和 gRNA 进行实验验证。结果表明，PathoGD 设计的引物和 gRNA 特异性高，能准确检测目标病原体，且在不同浓度下检测性能有差异。此外，针对淋病奈瑟菌多拷贝 gRNA 的研究发现，其虽信号积累慢，但特异性高，多拷贝 gRNA 组合可提高检测灵敏度。
研究结论和讨论部分指出，PathoGD 为 CRISPR - Cas12a 诊断应用提供了高通量、快速设计引物和 gRNA 的完整解决方案。它减少了对传统标记基因的依赖，利用两种互补方法探索基因组序列，为分子诊断向双靶点方法转变提供支持。同时，其可扩展性便于根据新测序基因组更新设计或评估已有设计。然而，PathoGD 也存在一些局限性，如 gRNA 设计局限于特定 PAM 位点、依赖准确的基因组数据库、未对设计进行评分等。未来可通过扩展对其他 Cas 核酸酶的支持、增加分类验证步骤、结合机器学习预测 gRNA 活性等方式改进。总体而言，PathoGD 在传染病诊断领域具有重要价值，为后续研究和诊断技术发展奠定了基础。
