用于灵长类动物和人类心脏修复的工程心肌同种异体移植

【字体: 时间:2025年01月30日 来源:Nature 50

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  利用诱导多能干细胞来源的心肌细胞进行心外膜工程心肌异体移植,可以安全有效地重建恒河猴慢性衰竭心脏,从而改善心脏功能,为人体临床试验铺平道路。

  

心肌修复新突破:工程化心肌移植物的研究进展


德国哥廷根大学医学中心胸心血管外科的研究人员在《Nature》期刊上发表了题为 “Engineered heart muscle allografts for heart repair in primates and humans” 的论文。该研究在心肌修复领域取得了重大进展,为心脏衰竭的治疗提供了新的方向和希望,其成果对推动组织工程心脏修复的临床应用具有重要意义。


一、研究背景


心肌梗死等原因导致的心力衰竭严重威胁人类健康。心肌细胞移植是实现心肌再肌化的一种潜在策略,在大动物研究、啮齿动物和兔子模型中均有相关数据支持。然而,之前的研究存在诸多问题,如在小动物模型中的结果难以准确预测大动物及人类患者的情况,尤其是异种移植研究受强免疫反应影响,且在免疫健全动物中,心肌细胞异种移植超过 3 个月的长期植入尚无证据。此外,同种异体移植成人干细胞研究中,也存在无明显再肌化和细胞保留有限的问题,这些研究结果可能至少部分由免疫反应或旁分泌机制介导。因此,开发一种安全有效的心肌修复方法迫在眉睫。


二、研究材料与方法


(一)细胞系


使用 4 种恒河猴诱导多能干细胞(iPS)系和 1 种人 iPS 细胞系 TC1133。恒河猴 iPS 细胞系来源于皮肤成纤维细胞,人 iPS 细胞系由脐带血细胞重编程而来,所有细胞系均经过 MHC(人)和 Mamu(恒河猴 MHC)分型进行身份验证,并检测无支原体污染。


(二)细胞分化


  1. 心肌细胞(CM)分化:采用 ABCF + I 分化协议,从人及恒河猴 iPS 细胞诱导分化为 CMs。该过程包括中胚层诱导、心脏定向分化、恢复和代谢选择等阶段,在不同培养条件下进行。

  2. 基质细胞(StC)分化:运用新开发的 ABCF - CRAB - VCF 协议,将人及恒河猴 iPS 细胞分化为具有成纤维细胞特性的 StCs,涉及多个步骤和不同的培养环境。


(三)工程化心脏肌肉(EHM)构建


将 CMs 和 StCs 按特定比例混合,与牛 I 型胶原蛋白和浓缩无血清培养基重构,在含有多种生长因子的培养基中培养,制备成用于植入的 EHM。


(四)动物实验


  1. 裸鼠实验:对 8 - 10 周龄雄性裸鼠进行缺血 - 再灌注(I/R)损伤处理,4 天后随机分为两组,分别植入活的或致死照射的恒河猴 EHM,术后进行超声心动图和组织病理学分析。

  2. 恒河猴实验:选取健康恒河猴和通过 I/R 损伤构建慢性心力衰竭模型的恒河猴。健康恒河猴分为两组,分别植入不同剂量的 EHM(1× 或 5×),并使用不同免疫抑制方案;心力衰竭模型的恒河猴随机分为对照组和 EHM 植入组(2× 或 5×),给予免疫抑制治疗。实验过程中进行 MRI、心电图监测、临床化学分析、组织病理学检查等。


(五)临床研究


在 BioVAT - HF Phase 1/2 临床试验中,对一名接受 EHM 植入的晚期心力衰竭患者进行研究,在患者心脏移植后获取心脏组织进行分析。


三、研究技术路线


  1. 开发并优化恒河猴 EHM 模型,通过与之前建立的符合良好生产规范(GMP)的人 EHM 配方进行对比,确认其在体外和体内(裸鼠模型)的等效性。

  2. 在健康恒河猴和心力衰竭恒河猴模型中进行 EHM 植入实验,探究不同剂量 EHM(1×、2×、5×)的效果,包括细胞保留、心脏功能改善、免疫反应等,并确定合适的免疫抑制方案。

  3. 对植入 EHM 的恒河猴和临床患者进行长期随访,通过多种检测手段(如 MRI、组织病理学分析、基因检测等)评估 EHM 的安全性和有效性,验证 EHM 植入后心肌再肌化的效果。


四、研究结果


(一)恒河猴 EHM 模型特性


  1. 细胞分化与 EHM 特性:所有应用的恒河猴 iPS 细胞系均可高效分化为 CMs 和 StCs,纯度经流式细胞术和单细胞核 RNA 测序(snRNA - seq)确认。恒河猴 EHM 与临床用人 EHM 在细胞组成、结构和收缩性能上相似,但恒河猴 EHM 的最大收缩力较低且具有物种特异性特征,如更高的搏动率。

  2. 裸鼠植入可行性:在裸鼠 I/R 损伤模型中,植入活的恒河猴 EHM 4 周后可检测到恒河猴 CMs,且未发现残留多能干细胞和畸胎瘤形成。同时,植入活 EHM 的裸鼠射血分数和每搏输出量显著增加。


(二)健康恒河猴 EHM 植入研究


  1. 免疫抑制方案与细胞保留:在健康恒河猴中进行不同免疫抑制方案的研究,发现他克莫司和甲基强的松龙联合使用可更好地促进细胞保留。在该免疫抑制方案下,高剂量(5×)EHM 在恒河猴体内可长期保留(6 个月),而免疫抑制在 3 个月后停药会导致同种异体移植物 CMs 排斥。

  2. EHM 剂量与心脏结构功能:观察到 EHM 剂量依赖性地增加目标心脏壁厚度,且对心脏功能无明显损害。连续心电图监测和详细病理分析未发现 EHM 植入存在安全问题,但临床化学分析显示存在他克莫司相关的副作用。

  3. 意外发现:在部分植入 EHM 的恒河猴中观察到终末分化的骨软骨细胞形成,该现象呈剂量依赖性,且未引起明显副作用。通过延长代谢 CM 选择时间可降低恒河猴 iPS 细胞衍生物的异质性。


(三)心力衰竭恒河猴 EHM 植入研究


  1. 安全性与免疫反应:在慢性心力衰竭恒河猴模型中,EHM 植入后大部分动物临床过程平稳,虽有他克莫司诱导的副作用,但未观察到供体特异性抗体(DSAs),外周血免疫细胞分析显示各白细胞亚群频率和激活状态无显著差异,尸检材料中白细胞浸润可忽略不计,且 CM 保留率较高。

  2. 心脏功能改善:EHM 植入可剂量依赖性地增加目标心脏壁厚度,部分动物的目标心脏壁收缩力和左心室射血分数持续增强,病理分析和心电图监测未发现 EHM 植入相关安全问题。

  3. 血管化与细胞特性:钆增强灌注磁共振成像(MRI)和组织病理学分析证实 EHM 移植物存在功能性血管化,植入的 CMs 为终末分化细胞,比受体动物的 CMs 小且相对不成熟,有闰盘形成和少量缝隙连接蛋白表达。


(四)临床研究结果


  1. CM 保留与细胞特性:通过对 BioVAT - HF 临床试验中一名患者的心脏组织分析,证实 EHM 植入后 CMs 可保留。植入的 CMs 比受体心脏 CMs 小,组织学分析显示其相对不成熟,且 EHM 移植物的毛细血管密度低于受体心脏。

  2. 免疫反应:患者在 EHM 治疗下病情稳定,但存在针对移植物或 TachoSil 支持材料的局部免疫反应,尽管给予了高剂量免疫抑制。


五、研究结论


研究人员通过在恒河猴和人类患者中的研究,证明了组织工程化心肌同种异体移植物和自体移植物植入可实现持续且功能相关的心肌再肌化,且无不可接受的副作用。在恒河猴实验中,未观察到心律失常和肿瘤形成,确定了 EHM 在健康恒河猴模型中的最大可行剂量(MFD)为 5×EHM。临床数据进一步证实了 EHM 植入在晚期心力衰竭患者中的心肌再肌化效果,为 EHM 作为晚期心力衰竭患者心脏移植桥接治疗的可行性提供了证据。


六、研究讨论


  1. 研究意义:本研究为组织工程心脏修复提供了关键的可行性、安全性和有效性数据,基于这些数据,已获批进行首例人体 BioVAT - HF - DZHK20 Phase 1/2 临床试验,旨在进一步研究经心外膜植入 EHM 同种异体移植物进行组织工程心脏修复的安全性和有效性。这一研究成果为心力衰竭的治疗开辟了新的道路,有望改善患者的预后。

  2. 研究局限性与展望:尽管取得重要进展,但仍面临一些挑战。例如,免疫细胞浸润在心脏移植患者中常见,需要进一步研究以改善 EHM 移植患者的预后。未来可探索低免疫策略、增强血管化的方法以及优化移植物几何形状,如通过 3D 打印技术,以进一步推进组织工程心脏修复的发展。同时,从本研究及其他正在进行的临床试验中积累的经验,将有助于深入理解如何实现人类心力衰竭心脏的再肌化,并取得更具临床意义的成果。


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