超氧化物歧化酶1聚集途径中物种结构调节的生物物理和光谱见解

超氧化物歧化酶1聚集与肌萎缩性侧索硬化症的发展密切相关，然而，其机制的理解仍然难以捉摸。在这里，作者报告了低聚物形成的关键步骤的生物物理和光谱研究，探测金属离子和二硫键的作用，以及槲皮素作为聚集抑制剂的作用模式。

　　

超氧化物歧化酶 1 聚集机制及槲皮素抑制作用的深度解析

印度理工学院德里分校的 Vijay Raj Tomar、Shilpa Sharma 等研究人员在Communications Chemistry期刊上发表了题为 “Biophysical and spectroscopical insights into structural modulation of species in the aggregation pathway of superoxide dismutase 1” 的论文。该研究借助多种先进技术手段，深入剖析了超氧化物歧化酶 1（SOD1）的聚集机制，明确了槲皮素对其聚集的抑制作用及机制，为肌萎缩侧索硬化症（ALS）的治疗药物研发提供了关键理论依据与潜在方向，对推动神经退行性疾病领域的研究进展意义重大。

一、研究背景

ALS 是一种极具破坏性的神经退行性疾病，会致使上下运动神经元退化，严重影响肌肉功能，患者往往在发病几年内就会死亡。其中，散发性（sALS）和家族性（fALS）分别占病例总数的 90% 和 10%，前者病因大多未知，后者则源于家族遗传。SOD1 作为一种金属酶，主要存在于细胞胞质中，能够催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧分子。它是由两个相同亚基组成的 32kDa 同源二聚体，每个亚基都含有一个铜离子、一个锌离子和一个分子内二硫键。在约四分之一的 fALS 病例中，突变 SOD1 的聚集被认为是主要致病因素；在 sALS 和 fALS 患者中，均能观察到 SOD1 免疫反应性聚集体。不过，尽管 SOD1 聚集与 ALS 之间的联系已较为明确，但 SOD1 聚集导致 ALS 的初始事件，以及金属离子在其中的作用和相互关系尚未完全明晰。此外，蛋白质聚集机制复杂，不同蛋白质即便二级结构相似，聚集机制也可能截然不同，这使得 SOD1 聚集机制的研究充满挑战。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

研究中使用的多种化学试剂，如硫代黄素 T（ThT）、8 - 苯胺基萘 - 1 - 磺酸（ANS）、异丙基 β - D - 1 - 硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）等，分别购自 Sisco Research Laboratories（SRL）、Merck、Biobasic 和 Qiagen 等公司。SOD1 蛋白按照先前的实验方案进行表达和纯化，其纯度通过 SDS - PAGE 进行检测，浓度则依据在 280nm 处的吸光度，利用摩尔消光系数来测定。

（二）实验方法

1. 尺寸排阻色谱（SEC）：从含有 30μM SOD1 的聚集动力学实验体系中，在不同时间点收集样品（有无 50μM 槲皮素存在的情况均进行收集）。样品经 0.22μm 注射器过滤器过滤后，取 500μl 注入 Superdex 200 Increase 10/300 GC 尺寸排阻柱，以 25mM pH7.4 的磷酸盐缓冲液作为流动相进行等度洗脱，在 254nm 和 280nm 波长处记录吸光度。运用 OriginPro 2020b 软件对蛋白质峰进行解卷积，进而获取二聚体和单体的曲线下面积。

2. 基于 ThT 的 SOD1 聚集动力学测定：选取 15μM、20μM、25μM、30μM 和 35μM 这五个不同浓度的 SOD1 蛋白进行聚集动力学实验，每个反应设置五个重复。在 37°C、25mM 磷酸盐缓冲液（pH7.4）的生理条件下，加入 2mM EDTA 和 80mM DTT 启动蛋白质聚集反应。通过添加 40μM ThT，将激发波长设定为 446nm，发射波长设定为 482nm，狭缝宽度设为 5nm，每隔 15min 记录一次数据。对于种子实验，先让 30μM 的蛋白质聚集 30h，然后将新鲜制备的种子超声处理后加入到新的 30μM SOD1 溶液中，以同样的方式监测动力学。同时，也对含有不同浓度槲皮素（10、30、40、50μM）的 30μM SOD1 溶液，以及含有 25μM 槲皮素的不同浓度（20、30、40、50μM）SOD1 蛋白溶液进行聚集动力学监测。

3. ANS 实验：为研究蛋白质疏水性的变化，将去除金属离子和二硫键的 30μM 蛋白质样品（分为含 50μM 槲皮素和不含槲皮素两组）与 600μM ANS 混合，在 120min 内，每隔 15min 记录一次荧光光谱。激发波长设定为 350nm，激发和发射狭缝宽度均设为 5nm，记录 400nm 至 700nm 的 ANS 光谱。

4. 表面增强拉曼光谱（SERS）：采用 Lee Meisel 方法制备等离子体银纳米颗粒（AgNP）。将 18mg 的

   溶解在 100ml 水中并加热至沸腾，加入 2ml 1% 的柠檬酸钠水溶液，搅拌 60min 后停止加热，搅拌冷却至室温，再用截留分子量为 14kDa 的纤维素膜透析 24h。通过离心将纳米颗粒溶液浓缩 10 倍，取 2μL 表达的蛋白质溶液与 10μL 经 2μL 1.0M NaCl 溶液活化的纳米颗粒溶液混合孵育 10min，取 10μL 混合溶液滴在铝基底上进行光谱采集。使用 Horiba Xplora 拉曼光谱仪，以 532nm 的激发激光和 50x 物镜收集拉曼光谱，设置孔、狭缝宽度和凹槽分别为 300μm、100μm 和 1800groves/mm，积累时间设为 10s，累积 30 次光谱得到最终光谱。运用 Origin 10 软件对光谱进行平滑、背景扣除等后处理，利用 Orange 软件进行主成分分析（PCA）。

三、研究结果

（一）SOD1 的聚集动力学

1. DTT 和 EDTA 诱导的聚集：在实验开始时，SOD1 样品中主要是二聚体，单体含量极少。随着 EDTA 和 DTT 的加入，二聚体逐渐转化为单体，在 30min 内几乎完全转化。通过对数据的拟合发现，该过程符合一级反应动力学，速率常数

   为

   ，这表明在聚集初始阶段，二聚体向单体的转化是关键且快速的事件。

2. 不同蛋白浓度下的聚集：通过监测 ThT 荧光强度随时间的变化来研究 SOD1 在不同浓度下的聚集动力学，发现其呈现出具有明显滞后期的 S 形曲线，这是成核过程的特征。种子实验表明，加入种子后滞后期完全消失，凸显了成核在聚集滞后期的重要性。随着蛋白浓度的增加，SOD1 的聚集速率呈线性上升。对 ThT 荧光数据的分析显示，SOD1 聚集初期的快速指数增长符合

   方程，暗示体系中存在二次途径。通过对相关参数的计算和分析，结合 Amylofit 软件对实验数据的全局拟合，发现 SOD1 的聚集机制以碎片化为主，碎片化机制下的初级成核反应级数

   为 2，表明形成的是二聚体核。同时，通过计算得到的缩放指数进一步证实了碎片化机制的主导地位。

（二）SOD1 天然二聚体和低聚物的结构

1. SERS 光谱分析：利用柠檬酸盐包覆的银纳米颗粒获取 SOD1 天然蛋白和低聚物的 SERS 光谱。SOD1 蛋白的 SERS 光谱中，1580

   和 1169

   的峰分别归属于苯丙氨酸的苯基 C - 拉伸振动和平面内 C - H 弯曲与环拉伸的组合振动；909

   和 937

   的双峰对应谷氨酸和天冬氨酸酸性侧链的 C - COO?拉伸振动；1613

   的峰被指定为酰胺 I 带，对应反平行 β - 折叠结构；1290

   的峰为酰胺 III 带；1531

   的峰为酰胺 II 带。在低聚物的 SERS 光谱中，出现了 667

   的 C - S 拉伸峰，这在天然蛋白光谱中不存在，表明在低聚过程中，Cys57 残基靠近纳米颗粒表面。此外，低聚物光谱中 1697

   的峰可归属于无规卷曲结构或羧基拉伸模式，说明纳米颗粒可能与含有无规卷曲结构的区域相互作用。

2. PCA 分析：对 SOD1、低聚物以及存在槲皮素时低聚物的 SERS 光谱进行 PCA 分析。结果显示，SOD1 天然二聚体和低聚物的蛋白簇在 PC1 成分上能够很好地分离，表明两者在结构上存在差异，尤其是在酰胺 II、酰胺 III 和无规卷曲区域。在存在槲皮素的情况下，低聚物与不存在槲皮素的低聚物在 PC1 和 PC2 成分上也能明显区分，进一步表明槲皮素会引起 SOD1 结构的变化，从而影响其聚集过程。

（三）槲皮素对 SOD1 聚集的影响

1. 对蛋白疏水性和聚集过程的影响：ANS 实验表明，槲皮素显著降低了 SOD1 蛋白疏水补丁的暴露程度。SEC 实验显示，在槲皮素存在时，天然二聚体向单体的转化速率减慢，形成的单体更紧密、展开程度更低，非天然二聚体的形成也减少。ThT 聚集实验表明，槲皮素延长了聚集的滞后期，降低了聚集速率，并且改变了聚集的动力学机制，使 SOD1 聚集不再以碎片化主导。

2. 对聚集动力学参数的影响：对不同浓度槲皮素存在下的 SOD1 聚集动力学数据进行拟合发现，槲皮素降低了初级和次级速率参数，且对初级速率参数的影响更大，这表明槲皮素主要通过降低延伸速率来抑制 SOD1 聚集。

3. 对聚集形态的影响：透射电子显微镜（TEM）图像显示，在槲皮素存在的情况下，几乎观察不到 SOD1 的纤维形成，而在不存在槲皮素时会形成较小的纤维。此外，在种子聚集实验中，槲皮素能够减缓预形成纤维的播种聚集效果，进一步证明其对 SOD1 聚集的抑制作用。

四、研究结论与讨论

本研究全面深入地揭示了 SOD1 聚集的复杂机制，以及槲皮素对其聚集的抑制作用。研究发现，SOD1 的聚集遵循碎片化主导的机制，非天然二聚体的形成是速率限制步骤。在该过程中，去除金属离子和二硫键后，天然蛋白二聚体会迅速转化为单体，此过程为一级反应；随后单体转变为伸展形式，并倾向于形成非天然二聚体，单体浓度的降低符合二级反应动力学；当达到临界浓度时，便迅速开始低聚化过程。SERS 研究为低聚物由伸展单体和非天然二聚体形成提供了有力支持，PCA 分析则表明低聚物在结构和表面特征上与天然二聚体既有相似之处，又在二级结构上存在差异，部分 β - 折叠转变为无规卷曲结构。

槲皮素作为一种有效的聚集抑制剂，通过多种方式抑制 SOD1 的聚集。它适度影响初始阶段二聚体向单体的转化，延迟非天然二聚体和可溶性低聚物的形成，并降低延伸速率。这一系列作用使得 SOD1 聚集得到有效抑制，减少了有毒聚集体的产生，为开发针对 ALS 的治疗策略提供了极具价值的方向。

然而，本研究也存在一定的局限性，目前对于聚集过程中形成的不同物种的特征尚未完全明确，仍需进一步深入研究。未来可基于本研究提出的机制，设计更为有效的抑制剂来抑制 SOD1 的聚集，减缓 ALS 的进展。同时，结合 SERS 和 SEC 等技术，有望更深入地阐释 SOD1 聚集的机制，为神经退行性疾病的治疗带来新的突破。

总体而言，该研究成果为理解 SOD1 聚集机制和开发潜在治疗方法奠定了坚实基础，对推动 ALS 等神经退行性疾病的研究和治疗具有重要的科学意义和临床应用前景。