PARP抑制相关的异染色质在smarca4缺陷细胞中增加了DNA复制应激和ATR抑制的易感性

【字体: 时间:2025年01月30日 来源:Cell Death Discovery 6.1

  

靶向 SMARCA4 缺陷肿瘤的新策略:PARP 与 ATR 联合抑制的协同效应


东京国家癌症中心研究所基因组应激信号实验室等多单位的研究人员 Kimiyoshi Yano、Megumi Kato 等,在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “PARP inhibition-associated heterochromatin confers increased DNA replication stress and vulnerability to ATR inhibition in SMARCA4-deficient cells” 的论文。该研究揭示了 PARP 抑制相关的异染色质在 SMARCA4 缺陷细胞中增加 DNA 复制应激并增强对 ATR 抑制的敏感性,为靶向 SMARCA4 缺陷肿瘤的治疗策略提供了潜在理论依据,在癌症治疗领域具有重要意义。


研究背景


ATR 激酶与癌症治疗


ATR 激酶是应对 DNA 复制应激(RS)的关键调节因子,在癌细胞中,许多遗传突变会导致 RS 水平升高,而 ATR 在维持复制叉的稳定性和促进细胞存活方面发挥着重要作用。抑制 ATR 可使癌细胞因复制叉崩溃和有丝分裂灾难而死亡,因此 ATR 成为癌症治疗的潜在靶点。目前,基于 ATR 抑制剂(ATRi)的临床试验正在开展,但尚未建立有效的治疗方案。


SWI/SNF 复合物与癌症


SWI/SNF 染色质重塑复合物通过调节核小体定位来调控基因转录和 DNA 损伤反应(DDR),超过 20% 的人类癌症存在 SWI/SNF 复合物亚基的突变。其中,SMARCA4 是 SWI/SNF 复合物的核心成分,其缺陷会导致 R 环介导的转录 - 复制冲突增加以及异染色质形成,使癌细胞对 ATR 活性产生依赖。


PARP 抑制剂与联合治疗


近年来,与 DDR 因子抑制剂联合使用以增强 ATRi 疗效的研究逐渐增多。聚(ADP - 核糖)聚合酶(PARP)抑制剂(PARPi)可通过捕获 PARP1 和阻止单链 DNA 断裂(SSB)等损伤的修复,在癌细胞中诱导 DNA 损伤。已有研究表明,PARPi 与 ATRi 联合在某些癌细胞中具有协同细胞毒性,但具体机制尚未完全明确。


研究材料和方法


细胞系和细胞培养


研究使用多种肺癌细胞系,包括 A549、H1299、H2172、SK - LU - 1、ABC1、H226 和 H1975 等,分别培养于相应的培养基中,并添加 10% 胎牛血清和青霉素 - 链霉素。通过慢病毒 cDNA 表达系统构建了 SMARCA4、ARID1A 和 PBRM1 恢复的细胞系,利用 CRISPR/Cas9 技术构建了 SMARCA4 敲除细胞系。


药物处理


使用多种抑制剂,如 ATRi(tuvusertib)、ATMi(lartesertib)、DNA - PKi(peposertib)、PARPi(niraparib)等,以及对照药物和相关试剂,所有化合物均溶解于 DMSO 用于体外实验。


实验技术


采用细胞活力测定、蛋白质免疫印迹、免疫荧光、邻近连接分析(PLA)、DNA 纤维分析和动物实验等技术。细胞活力测定使用 CellTiter - Glo 2.0 试剂;蛋白质免疫印迹用于检测蛋白表达和磷酸化水平;免疫荧光和 PLA 用于观察细胞内蛋白定位和相互作用;DNA 纤维分析用于监测复制叉速度;动物实验通过建立裸鼠移植瘤模型评估药物疗效。


研究结果


ATRi/PARPi 联合在 SMARCA4 缺陷的 LUAD 细胞中展现更强协同作用和敏感性


研究人员对多种 SWI/SNF 缺陷的肺癌细胞系进行细胞活力筛选,评估 ATRi 与 DDRis 联合的协同细胞毒性。结果显示,在大多数测试的癌细胞系中,lartesertib 和 niraparib 与 tuvusertib 联合具有协同效应,且 tuvusertib/niraparib 组合在 SMARCA4 缺陷细胞中的协同得分和敏感性得分更高。补充表达 SMARCA4 可降低这些得分,证实了 SMARCA4 缺陷增强了 tuvusertib/niraparib 诱导的细胞毒性。


ATRi/PARPi 联合在 SMARCA4 敲除细胞中引发细胞毒性和 DNA 损伤敏感性


通过建立 SMARCA4 敲除细胞系进一步验证,结果表明 SMARCA4 敲除细胞对 tuvusertib 或 niraparib 单药更敏感,低浓度的 tuvusertib 和 niraparib 联合在 SMARCA4 敲除细胞中显示出明显的协同效应,而在野生型细胞中需要更高浓度。联合处理显著增加了 SMARCA4 敲除细胞中 γH2A.X 信号,表明 DNA 损伤增加,提示 tuvusertib/niraparib 联合可能是治疗 SMARCA4 缺陷肺癌的有效方法。


PARPi 诱导的异染色质依赖性 RS 与 ATR 依赖的复制叉进展和细胞存活相关


利用 DNA 纤维分析发现,在 PARPi 处理的细胞中,复制叉的进展依赖于 ATR 活性。低浓度的 tuvusertib 和 niraparib 联合显著降低了复制叉速度,表明 PARPi 诱导的 RS 使复制叉依赖 ATR 进行进展。进一步研究发现,PARPi 诱导 H3K9me2 相关的异染色质积累,增加了 RS,而抑制 H3K9me2 可恢复复制叉速度并减轻 DNA 损伤,说明 PARPi 诱导的异染色质是增加对 ATRi 敏感性的关键 RS 来源。


SMARCA4 缺陷通过 Mre11 和 Mus81 核酸酶加剧 ATRi/PARPi 诱导的 DNA 损伤


研究表明,SMARCA4 缺陷细胞依赖 ATR 活性维持复制叉进展,tuvusertib 单药可显著降低 SMARCA4 敲除细胞的复制叉速度。PARPi 促进 H3K9me2 相关异染色质积累,进一步加剧了 SMARCA4 敲除细胞的 DNA 损伤。当同时抑制 ATR 和 PARP 时,Mre11 和 Mus81 核酸酶协同作用,导致大量复制叉崩溃,说明 SMARCA4 缺陷细胞在 ATRi/PARPi 联合处理下,DNA 损伤加剧是通过 Mre11 和 Mus81 核酸酶介导的。


ATRi/PARPi 联合治疗抑制 SMARCA4 缺陷的 LUAD 异种移植模型中的肿瘤生长


在裸鼠异种移植瘤模型中,连续给予 niraparib 和间歇给予 tuvusertib 的联合治疗方案耐受性良好。在 SMARCA4 缺陷的移植瘤模型中,联合治疗显著抑制肿瘤生长,比单药治疗效果更明显,这与体外实验结果一致,表明 PARPi 联合 ATRi 以及 SMARCA4 缺陷作为生物标志物,对发挥 ATRi 的抗肿瘤活性至关重要。


研究结论


本研究发现 PARPi(niraparib)与 ATRi(tuvusertib)联合在 SMARCA4 缺陷的肺癌细胞系和异种移植模型中具有显著的协同抗肿瘤活性。PARPi 诱导的 H3K9me2 相关异染色质增加了复制应激,使复制叉进展和细胞存活更加依赖 ATR 活性,从而增强了对 ATRi 的敏感性。在 SMARCA4 缺陷细胞中,ATRi/PARPi 联合通过 Mre11 和 Mus81 核酸酶加剧 DNA 损伤,导致复制叉崩溃和细胞死亡。


研究讨论


临床意义


SMARCA4 突变在约 7 - 8% 的肺腺癌患者中存在,本研究为针对 SMARCA4 缺陷肿瘤的 ATR/PARP 联合治疗提供了理论依据。之前的临床研究显示 ATR/PARPi 联合治疗的响应率有限,而本研究表明,以 SMARCA4 缺陷作为生物标志物,在生物可利用的低剂量下,该联合治疗可能对部分患者有益,为优化癌症治疗方案提供了新方向。


作用机制


SWI/SNF 复合物在调节基因组结构和 DNA 损伤修复中起重要作用,SMARCA4 缺陷会导致染色质凝缩和异染色质形成,增加复制应激。PARP 不仅参与 DNA 修复,还在染色质重塑中发挥作用,PARPi 可通过多种机制促进异染色质形成,增加对 ATRi 的敏感性。此外,研究还探讨了复制叉在异染色质区域的进展机制,以及 ATR、PARP 和相关核酸酶在其中的相互作用。


未来展望


虽然本研究在临床前模型中取得了有意义的结果,但仍需进一步在免疫健全模型中测试 ATRi 和 PARPi 的给药方案,以评估其对先天免疫反应和免疫治疗的影响。这将有助于进一步优化治疗策略,提高癌症患者的预后,为癌症治疗领域带来新的突破和希望。


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