从衰老体细胞高效构建猴囊胚样结构胶囊：胚胎发育研究新突破

为解决猴囊胚样结构（blastoids）形成效率低等问题，昆明理工大学研究人员开展从衰老体细胞构建猴 blastoids 及制备其胶囊的研究。结果使 blastoids 形成效率达 80%，并制备出可调控的胶囊。该成果推动胚胎发育研究及再生医学发展。

　　

在生命科学的探索旅程中，胚胎发育一直是一个充满奥秘的领域。早期胚胎发育的研究对于理解生命起源、揭示疾病发生机制以及推动再生医学发展至关重要。然而，这一研究面临着诸多挑战。研究人类早期胚胎发育，因伦理限制，无法随意获取大量捐赠的人类胚胎进行研究 。而类囊胚（blastoids）作为一种体外构建的类似囊胚的结构，为研究早期胚胎发育提供了新途径。它由幼稚多能干细胞（PSCs）经过一系列分化和自组织过程形成，能模拟人类胚胎从着床前到原肠胚形成早期的发育过程。但目前研究发现，非人类灵长类动物（NHPs）的 PSCs 来源的 blastoids 研究较少，且猴 blastoids 的形成效率低，通常低于 30%，严重限制了其在科研和医学领域的应用。此外，利用衰老个体的自体 PSCs 构建 blastoids 尚未见报道，而这对于研究衰老个体的组织再生具有重要意义。在这样的背景下，昆明理工大学的研究人员开启了一场探索之旅，致力于攻克这些难题，相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

为了解决上述问题，昆明理工大学的研究人员开展了一系列研究。研究人员旨在建立高效的猴 blastoids 生成系统，并制备具有可扩展性和稳定性的 blastoids 胶囊。研究人员从年轻和年老恒河猴的成纤维细胞中获取多种细胞来源，包括猴胚胎干细胞（M-ESCs）、猴诱导多能干细胞（M-iPSCs）和猴体细胞核移植胚胎干细胞（M-nt-ESCs） ，以此作为起始细胞进行 blastoids 的构建。同时，运用微流控技术和水凝胶材料，制备出可调控的 blastoids 胶囊。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。在细胞培养与重编程方面，从猴皮肤分离成纤维细胞，利用体细胞核移植（SCNT）和仙台病毒介导的非整合基因重编程技术，将其转化为 M-iPSCs 和 M-nt-ESCs。在 blastoids 构建方面，通过优化培养条件，如添加特定小分子化合物和调整培养基成分，诱导 PSCs 形成 blastoids。在分析检测方面，运用免疫荧光染色和单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术，对 blastoids 的细胞谱系组成和基因表达特征进行分析。在材料制备方面，合成光固化水凝胶（GelMA），并利用微流控乳液技术制备 blastoids 胶囊。

研究结果

1. 猴 blastoids 的生成：研究人员发现，在先前建立的培养基（XF-PSC 培养基）中添加 CloneR 以及小分子化合物 DDD00033325（Pro-S）或 Y2763225，能有效促进 M-ESCs 传代后的存活。使用 “CloneR + Pro-S” 组合处理细胞，细胞死亡率最低且增殖水平最高。采用特定的培养基组合，即先使用下胚层分化培养基（HDM），再使用改良的滋养层分化培养基（TSG），可诱导 M-ESCs 分化为类似囊胚所有细胞类型的细胞。通过该方法，猴 blastoids 的形成效率达到了 80% 以上。
2. 高代次细胞系来源的猴 blastoids 生成：研究表明，增加起始细胞数量（最多至 200,000）和延长 HDM 培养时间，有助于高代次（passage >25）M-ESCs 形成 blastoids。当起始细胞数约为 100,000 且 HDM 培养 3 天时，blastoids 形成效率最高且特征最佳。
3. 猴 blastoids 的谱系组成：免疫荧光染色分析显示，猴 blastoids 中不同细胞谱系的标记物表达符合预期。POU5F1（OCT4）在类似上胚层细胞（ELCs）中高表达；GATA4 和 GATA6 在类似下胚层细胞（HLCs）中表达；GATA3 在类似滋养层细胞（TLCs）中染色阳性，且 TLCs 间的紧密连接通过 ZO-1 的表达得到验证。单细胞转录组分析表明，猴 blastoids 与已发表的 blastoids（人类和猴）及囊胚（猴）在基因表达模式和谱系组成上具有相似性，但也存在转录差异，为进一步优化猴 blastoid 模型提供了资源。
4. 从年轻和年老体细胞建立 PSCs 系：研究人员成功从年轻和年老猴的成纤维细胞中，通过 SCNT 和基因重编程技术分别建立了 M-nt-ESCs 和 M-iPSCs 系。这些细胞系均表达预期的多能性标记基因，具有分化为三个胚层的能力，并保持正常核型。
5. 从年轻和年老 PSCs 生成猴 blastoids：以 M-iPSCs 和 M-nt-ESCs 为起始细胞，成功构建出猴 blastoids，其形态与 M-ESCs 来源的 blastoids 相似。免疫荧光染色证实了三种谱系标记物的表达。虽然年老供体细胞来源的 M-iPSCs 和 M-nt-ESCs 构建的猴 blastoids 空化效率较年轻供体细胞来源的略低，但仍可达约 60%。
6. 干细胞系的衍生：从单个培养的 blastoids 中成功衍生出 ESCs、TSCs 和 ExEnd 细胞系（bELCs、bTLCs 和 bHLCs），这些细胞系可在体外稳定传代超过 10 代。免疫荧光检测显示，它们表达相应的特异性标记物，且 TSCs 可成功分化为合体滋养层（ST）样细胞。
7. blastoids 的体外着床建模：体外培养实验表明，blastoids 在附着后会发生形态变化，形成类似着床后胚胎的结构，并分泌猴绒毛膜促性腺激素（mCG）。将 blastoids 移植到代孕母猴体内后，虽 mCG 水平升高，但未观察到进一步发育的明显证据。
8. 包封猴 blastoids 的水凝胶的合成与性能：合成的光固化水凝胶（GelMA）经 1H-NMR 验证成功合成，其光固化性能良好，在 37°C 下体外降解 42 天后仅残留 10%，在去离子水中孵育 10 小时后体积膨胀三倍并保持稳定。与 M-ESCs、M-iPSCs 和 M-nt-ESCs 共培养显示出良好的生物相容性，猴 blastoids 在包封后能够在水凝胶中增殖。
9. 猴 blastoid 胶囊的高通量制备：通过微流控乳液技术，可制备出单分散、一致性好且可重复的 blastoid 胶囊。该技术可通过调节油相流速制备不同直径的胶囊，最大粒径 550μm，最小粒径 260μm，调整油相流速至 75mL/hour 时，可制备平均粒径 227μm 的水凝胶胶囊和平均粒径 266μm 的 blastoid 胶囊，每小时最多可生产 4000 个 blastoid 胶囊。blastoid 胶囊在猴输卵管中的递送率较高，且水凝胶对猴 blastoids 的结构影响较小。

研究结论与讨论

昆明理工大学的研究人员成功建立了从多种细胞来源高效生成猴 blastoids 的方法，将形成效率从以往的 30% 提升至 80%，并首次利用自制微流控系统制备出可调控的猴 blastoid 胶囊。这一研究成果为胚胎发育研究提供了有力的模型，有助于深入探究胚胎发育机制，同时也为再生医学的发展带来了新的希望。然而，目前研究仍存在一定局限性，如构建的 blastoids 中滋养层细胞的质量和功能有待进一步提高，这直接影响着胎盘界面的形成。未来研究可致力于优化细胞培养技术，结合先进的基因和生物工程方法，提升细胞性能，提高猴 blastoids 体内移植的成功率，更深入地模拟胚胎发育的自然过程，为生命科学和健康医学领域的发展做出更大贡献。