超越基因组学：使用来自干血斑点的RNA-seq来解锁剪接变异在诊断环境中的临床相关性

　　

突破基因组学局限：干血斑 RNA 测序解锁剪接变异临床诊断意义

德国 CENTOGENE GmbH 的 Aida M. Bertoli-Avella 等人在《European Journal of Human Genetics》期刊上发表了名为 “Beyond genomics: using RNA-seq from dried blood spots to unlock the clinical relevance of splicing variation in a diagnostic setting” 的论文。该研究借助干血斑 RNA 测序技术，深入探究剪接变异的临床意义，为遗传诊断开辟了新路径，在提升罕见病诊断效率、精准解读基因变异等方面意义重大。

一、研究背景

临床外显子组和基因组测序是罕见病的一线诊断方法，但仍有许多患者无法确诊。部分原因在于检测无法发现 DNA 变异，如非编码变异难以被外显子组测序检测到；还有对检测到的变异解读困难，像基因组测序发现的非编码变异，其影响往往未知；此外，基因功能未知也导致难以诊断。

RNA 测序（RNA-seq）作为遗传诊断的有效补充工具，可重新分类部分意义不明的变异（VUS），提高诊断率。不过，此前多数研究使用的 RNA 样本来自血液、培养的成纤维细胞或活检组织，获取高质量 RNA 在资源有限的临床环境中并非易事。因此，开发新的 RNA 样本采集方法十分必要。

二、研究材料与方法

（一）患者样本

研究在诊断环境下开展，获取了患者、法定监护人或转诊医生的书面知情同意。DNA 通常从干血斑（DBS）中提取，随后进行下一代测序（包括基因 panel、外显子组测序、基因组测序）、酶活性测量和生物标志物定量分析。研究选取了 108 名患者，这些患者在基因 panel、外显子组或基因组测序后报告存在剪接变异，且满足研究分析同意、样本可用（DBS 采血后不超过 14 天）、感兴趣基因血液表达充足等条件。

（二）RNA 提取

CENTOGENE 收到用于外显子组 / 基因组测序的 CentoCards? 后，将其分割用于 DNA 和 RNA 测序，并储存在 -80°C 以防止 RNA 降解。从滤卡上剪下两个完整血斑，使用 Zymo Quick-RNA Miniprep Kit 及内部开发的提取方案提取 RNA，同时用 Agilent 4200 Tapestation System 评估 RNA 完整性数（RIN），用 Qubit RNA High Sensitivity Assay 测量 RNA 数量。

（三）文库制备与测序

以每位患者 50 ng 总 RNA 为起始材料构建 RNA 文库，先利用 oligo (dT) 磁珠分离 poly (A) mRNA，再用 Watchmaker Polaris Depletion Kit 去除球蛋白 mRNA，后续按 Watchmaker RNA Library Prep Kit 试剂盒方案进行文库制备，并优化条件。纯化后的扩增文库用 Agilent 4200 Tapestation System 评估质量和浓度，等摩尔混合后在 Illumina NextSeq 500 或 Illumina NovaSeq 6000 S4 上测序，采用 150 bp 双端测序方案。

（四）生物信息分析与统计分析

RNA-seq 原始数据用 STAR v.2.7.6a 以双程模式比对到 hg19 参考基因组，用 Picard tools v.2.23.8 处理读段和标记重复，用 featureCounts/subread v.2.0.1 计数读段，用 StringTie v2.1.4 计算标准化表达水平（TPM、RPKM）。用 R 语言的 Pearson 相关函数计算 RNA 质量指标间的相关性，描述性统计以中位数（四分位数间距）和比例呈现。

三、研究结果

（一）样本和变异特征

研究选取的 108 个样本中，多数样本（59%）的卡片保存时间不超过 7 天，42% 的样本卡片保存时间在 8 - 15 天。样本主要来自中东 / 北非地区（63%）和拉丁美洲（18%）。113 个变异中，多数为杂合变异（72%），位于非编码区域且不影响规范剪接位点（57%）。

（二）RNA 测序质量控制

提取 RNA 的 RIN 中位数为 3.6，RIN 与平均 RPKM 值相关性低（皮尔逊相关系数：-0.1），与 RNA 浓度无相关性（皮尔逊相关系数：0.03），卡片保存时间与 RIN 值呈弱负相关（皮尔逊相关系数：-0.3）。测序获得的读段插入大小约 200 bp，样本测序深度中位数为 4600 万读段。对比 PAX 管血样和 DBS 样本的基因表达，两者相关性强（0.93），且在检测与 OMIM 疾病相关基因时重叠度高。不过，因 RNA 降解或表达低于预期，24 个变异无法分析。

（三）异常剪接模式

113 个变异中，64 个（57%）确认存在异常剪接，15 个（13%）未观察到剪接改变，34 个因样本不可分析（21%）或读段数不足（9%）无法判断剪接效应。异常剪接中最常见的事件是外显子跳跃（31 个变异，48%），其他包括隐秘供体 / 受体位点使用（25 个，39%）、内含子保留（4 个，6%）和其他复杂事件（4 个，6%）。对比 SpliceAI 预测分数和 RNA-seq 结果，64 个异常剪接变异中，43 个（68%）SpliceAI 分数高于 0.8，但部分变异 SpliceAI 分数与 RNA-seq 结果不符。

（四）临床相关变异

在与患者主要临床问题和表型相关的变异中，35 个（51%）被分类为致病性（P）/ 可能致病性（LP），30 个（46%）为 VUS，4 个为风险因素。在这些变异中，46 个（70%）确认存在异常剪接，其中 4 个变异分类从 VUS 升级为 LP。

四、研究结论与讨论

研究团队利用干血斑进行 RNA 测序，建立了与基因组检测同一样本的 RNA 测序流程。研究表明，尽管部分样本 RNA 起始质量欠佳，但干血斑仍能提供足够 RNA 用于测序和变异分析，且 RIN 指标与测序所需 RNA 输入量相关性不强。

干血斑 RNA 测序优势显著。它可在同一 DNA 测序样本上进行，节省时间和资源，减少患者多次就诊和重新采样的麻烦，尤其适用于偏远地区患者。不过，该技术也存在局限性，如干血斑 RNA 基因表达水平低于其他生物样本。

研究通过 RNA 测序确认了部分已知致病变异的 RNA 改变，为疾病诊断提供了有力证据。同时，对于 VUS，RNA 测序有助于明确其影响，重新分类部分变异，推动精准诊断。

这项研究为遗传诊断提供了新的多组学方法，将 RNA 测序与外显子组 / 基因组测序相结合，提高了诊断率，辅助了变异分类。未来，研究团队计划进一步拓展 RNA 测序在罕见病常规诊断中的应用，有望为更多患者带来精准诊断和有效治疗的希望，推动整个遗传诊断领域的发展。