编辑推荐：
在冷冻电镜断层扫描（cryo - ET）研究中，原位结构分析存在技术瓶颈。研究人员开展细菌核糖体原位快速结构分析研究，建立了快速样本制备和数据分析流程，解析出 70S 核糖体结构并发现 100S - 样双体，有助于研究微生物核糖体相关机制。
在生命科学的微观世界里，探索细胞内大分子的结构与功能是至关重要的任务。冷冻电镜断层扫描（cryo - ET）技术为我们打开了一扇观察细胞内大分子复合物结构的窗户。然而，目前该技术在原位结构分析方面却困难重重。传统的样本制备和成像通量低，数据处理不仅耗时费力，还需要大量计算资源，即使对于像核糖体这样丰富的大分子复合物，获取高分辨率的原位结构也常常需要数周甚至数月时间。这就好比在黑暗中摸索，虽然知道目标就在前方，却因为道路崎岖而难以到达。
为了突破这些困境，来自美国麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology）和密歇根大学（University of Michigan）的研究人员 Barrett M. Powell、Tyler S. Brant、Joseph H. Davis 和 Shyamal Mosalaganti 等展开了深入研究。他们致力于建立一种快速的原位 cryo - ET 样本制备和数据分析工作流程，期望能够高效地解析细菌核糖体的结构。
最终，他们成功建立了一套完善的流程。利用冷冻聚焦离子束铣削（cryo - FIB）技术，从大肠杆菌（E. coli）培养细胞出发，在不到 10 天的时间内就获得了分辨率为 5.8 ? 的 70S 核糖体结构。并且，他们还发现了一种 100S - 样双体的核糖体亚群。这一成果意义非凡，不仅为研究微生物核糖体的生物发生和翻译过程提供了有力工具，还能帮助我们深入了解遗传、环境和药物干扰对核糖体结构的影响，就像为细胞内的微观世界绘制了一幅更清晰的地图，让我们能更准确地探索其中的奥秘。该研究成果发表在《Communications Biology》上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是 cryo - FIB 铣削技术，将大肠杆菌样本制成适合高分辨率成像的薄片；然后通过 SerialEM 软件在 Titan Krios G4i 透射电子显微镜上进行自动化数据采集；最后利用 Warp、IMOD、RELION、M 和 tomoDRGN 等软件进行数据处理和分析。
研究结果如下：
- 高通量数据采集的优化流程：对于像大肠杆菌这样较厚的细菌样本，研究人员采用 cryo - FIB 铣削技术，以 6° - 8° 的铣削角度（对应 13° - 15° 的样品台倾斜度），在 7 小时的铣削过程中，平均每次能获得约 20 个薄片。随后，将样本转移到显微镜上，通过 SerialEM 软件进行自动化数据采集，平均每 13 分钟采集一个剂量对称的倾斜系列，在收获培养物后的两天内就能生成完整的 cryo - ET 数据集。
- 高效数据处理的简化流程：在数据处理阶段，研究人员先用 Warp 软件进行电影对齐和显微图像对比度传递函数（CTF）估计，再通过 IMOD 软件进行自动补丁跟踪。经过筛选，保留 44 个倾斜系列用于后续分析。利用模板匹配从断层图像中提取粒子，每个断层图像提取 1000 个粒子。之后，通过 RELION、M 和 tomoDRGN 软件对粒子进行逐步处理和分析，在 7 天内完成数据处理，有效过滤掉错误选择的粒子，为后续更详细的分析做好准备。
- 数天内获得原位结构洞察：经过三轮数据处理迭代，最终获得了分辨率约为 5.8 ? 的 70S 核糖体结构。通过与传统的基于 RELION 3 - D 分类的子断层图平均（STA）处理方法对比，发现 tomoDRGN 在过滤垃圾粒子和识别高质量粒子方面更具优势。此外，研究人员还利用该流程分析了核糖体的空间关系，发现了与不同翻译状态相关的核糖体排列，如活跃翻译的双体和三体、100S - 样 “休眠” 双体以及与膜相关的核糖体等。特别值得一提的是，他们发现的 100S - 样双体虽然与之前报道的 100S 休眠核糖体结构有相似之处，但也存在明显差异，这为进一步研究核糖体的功能和调控机制提供了新的线索。
研究结论和讨论部分指出，该研究建立的快速原位结构分析流程具有重要意义。它为研究微生物核糖体的生物学过程提供了强大的工具，能够帮助我们在分子水平上理解细胞内的 “分子社会学”。虽然目前该研究已经取得了显著成果，但仍有进一步改进的空间。例如，在样本制备方面，新的仪器和控制软件有望减少冰晶污染，加快高质量薄片的制备速度；在数据采集方面，机器学习方法和更快的光束移动技术可能会缩短数据采集时间；在数据处理方面，更准确、高效的粒子挑选软件和统一的处理工作流程将提高分析效率和分辨率。这些改进将推动原位结构生物学的发展，让我们能更深入地探索细胞内大分子的奥秘，为生命科学研究带来更多突破。
