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稻瘟病菌严重影响水稻产量。为探究其碳代谢调控机制，研究人员开展了稻瘟病菌碳代谢相关研究。结果发现由蛋白磷酸酶 4 介导的多层调控网络，该成果为理解真菌碳代谢和致病性提供新视角。
在神秘的微生物世界里，稻瘟病菌如同隐藏在稻田中的 “杀手”，每年都给水稻带来巨大的灾难，导致 10 - 30% 的产量损失。稻瘟病菌在寄生和腐生阶段不断转换，适应不同的碳源环境对其生存和致病至关重要。然而，在过去，科学家们虽然知道碳代谢对稻瘟病菌很重要，但对于碳代谢的具体调控机制却知之甚少，尤其是在丝状真菌中，碳代谢调控的复杂性如同迷雾，难以捉摸。这就好比在黑暗中摸索，不知道方向，无法有效控制稻瘟病菌的危害。
为了揭开这层神秘的面纱，来自浙江大学等多个研究机构的研究人员，踏上了探索之旅。他们开展了关于稻瘟病菌碳代谢调控机制的研究。最终，他们发现了一个由蛋白磷酸酶 4（PP4c）介导的多层调控网络，这个网络对稻瘟病菌的生长、发育、致病性以及碳源利用起着关键作用。这一发现就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为我们理解真菌碳代谢和致病性提供了新的视角，也为农业生产中防治稻瘟病菌带来了新的希望。该研究成果发表在《Communications Biology》杂志上。
研究人员在此次研究中运用了多种技术方法。通过酵母双杂交（Y2H）、GST pull - down 和免疫共沉淀（CoIP）技术，确定了蛋白间的相互作用；采用基因敲除和表型分析技术，探究基因功能；利用逆转录定量 PCR（RT - qPCR），检测基因转录水平；运用 Phos - tag SDS - PAGE 和质谱分析技术，分析蛋白的磷酸化状态。
Pp4c 与其他蛋白的相互作用
研究人员首先通过酵母双杂交（Y2H）筛选与 Smek1 相互作用的蛋白，发现了 MGG_01528（Pp4c），并通过系统发育分析表明其与人类 Pp4c 和酵母 Pph3 密切同源。之后，通过 Y2H、GST pull - down 和免疫共沉淀（CoIP）实验，在体外和体内证实了 Pp4c 与 Smek1、Crf1 和 CreA 的相互作用。同时，也确定了蛋白激酶 Snf1 与 Crf1 和 CreA 存在相互作用。这些相互作用暗示着它们在稻瘟病菌碳代谢调控中可能扮演重要角色。
Pp4c 对稻瘟病菌生长和致病性的影响
研究人员通过基因敲除和表型分析，探究 Pp4c 对稻瘟病菌生长和致病性的影响。结果显示，Δpp4c 突变体在完全培养基（CM）上生长缓慢，分生孢子梗和孢子数量减少，分生孢子萌发率降低，附着胞形成延迟。在大麦和水稻上的致病性实验表明，Δpp4c 突变体的毒力严重受损，其在大麦叶片上仅产生小的棕色斑点，在水稻幼苗上产生小而分散的病斑，疾病指数显著低于野生型。进一步分析发现，Δpp4c 突变体的穿透率和侵入菌丝生长速度明显降低，这表明 Pp4c 对稻瘟病菌的生长和致病性至关重要。
Pp4c 参与脂质和糖原的利用
研究人员通过标记脂质滴和糖原颗粒，观察它们在 Δpp4c 突变体中的降解情况。结果发现，Δpp4c 突变体中糖原降解延迟，在 8 hpi 时，野生型孢子几乎没有可见的糖原颗粒，而 65.74 ± 3.34% 的 Δpp4c 孢子仍保留糖原颗粒。脂质滴降解也出现延迟，在 12 hpi 时，Δpp4c 孢子比野生型保留更多脂质滴。此外，通过测量甘油三酯含量，发现 Pp4c 和 Snf1 增强体内甘油三酯的分解代谢，而 CreA 抑制其分解代谢，这表明 Pp4c 在脂质和糖原利用中发挥重要作用。
Pp4c 和 Snf1 对碳源利用的调控
研究人员通过在含有不同碳源的培养基上培养野生型和突变体菌株，研究 Pp4c 和 Snf1 在脂质和碳水化合物代谢中的作用。结果表明，除野生型和 Δcrf1 外，其他菌株在葡萄糖和 D - 木糖培养基上生长缓慢，在 L - 阿拉伯糖、橄榄油、甘油和乙醇培养基上，大多数突变体生长明显缓慢。进一步比较双突变体的生长情况，发现 Pp4c、Snf1 与 CreA、Crf1 在碳源利用调控中存在复杂的相互作用，它们共同调节稻瘟病菌对不同碳源的利用。
Pp4c、Snf1 和 CreA 对基因表达的调控
研究人员运用 RT - qPCR 技术，定量分析 Δpp4c、Δsnf1 和 ΔcreA 突变体中与脂质代谢和 L - 阿拉伯糖代谢相关基因的转录水平。结果发现，CreA 作为转录抑制因子，抑制脂质分解代谢和糖异生相关基因的表达，同时也抑制 L - 阿拉伯糖分解代谢基因的表达；Snf1 和 Pp4c 则作为转录激活因子，促进这些基因的表达。此外，研究还发现这些调控因子之间存在相互影响，如 L - 阿拉伯糖激活 Crf1，进而促进 SNF1 的表达。
Pp4c 和 Snf1 对 Crf1 和 CreA 磷酸化状态的调控
研究人员以 L - 阿拉伯糖为代表的非首选碳源，通过 Phos - tag SDS - PAGE 和质谱分析，研究 Pp4c 和 Snf1 对 Crf1 和 CreA 磷酸化状态的调控。结果表明，在野生型中，CreA 和 Crf1 在 L - 阿拉伯糖培养基中比在葡萄糖培养基中去磷酸化程度更高。Snf1 在葡萄糖培养基中磷酸化 CreA 和 Crf1，而在 L - 阿拉伯糖培养基中，Snf1 通过 Pp4c 间接去磷酸化 CreA 和 Crf1。研究还确定了 CreA 和 Crf1 存在多种磷酸化状态，这些磷酸化状态的变化影响它们的活性，进而调控碳源利用。
Snf1 和 Pp4c 相互调节磷酸化状态
研究人员通过 Y2H、GST pull - down 和 CoIP 实验，发现 Snf1 与 Pp4c 和 Smek1 直接相互作用。通过 Phos - tag SDS - PAGE 分析，发现 Snf1 促进 Pp4c 的磷酸化，在 L - 阿拉伯糖培养基中，Δsnf1 菌株中 Pp4c 的磷酸化水平低于野生型。同时，Smek1 和 Pp4c 负责 Snf1 的去磷酸化，在 L - 阿拉伯糖培养基中，野生型中 Snf1 的磷酸化水平降低。这表明 Snf1 和 Pp4c 相互调节磷酸化状态，共同调控碳代谢。
研究人员发现了由蛋白磷酸酶 4（PP4c）介导的多层调控网络，该网络协调稻瘟病菌对首选和非首选碳源的利用。在利用非首选碳源（如 L - 阿拉伯糖）时，PP4 磷酸酶（Smek1 和磷酸化的 Pp4c）使 Snf1 去磷酸化，去磷酸化的 Snf1 再磷酸化 Pp4c，进而去磷酸化 CreA，解除其对非首选碳源利用基因表达的抑制作用；同时，磷酸化的 Pp4c 和 Smek1 使多磷酸化的 Crf1 去磷酸化，促进 SNF1 和非首选碳源利用基因的表达。在利用首选碳源（如葡萄糖）时，磷酸化的 Snf1 磷酸化 Crf1，使其失去促进非首选碳源利用基因表达的能力，同时磷酸化的 Snf1 使 CreA 低磷酸化，抑制非首选碳源利用基因的表达。
这项研究不仅揭示了稻瘟病菌碳代谢调控的关键机制，也为理解其他植物病原真菌的碳代谢和致病性提供了重要参考。它为农业生产中开发针对真菌碳代谢的疾病预防策略提供了理论依据，有助于减少稻瘟病菌等真菌病害对农作物的危害，保障粮食安全。
