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这篇综述聚焦癌症免疫学与免疫疗法。探讨了现代癌症免疫疗法面临的挑战，介绍多种筛选策略（如 CRISPR/Cas9 系统）及其在不同免疫细胞中的应用，分析了体内外筛选模型，为寻找癌症免疫治疗新靶点提供了全面视角，极具科研价值。
引言
肿瘤是一种复杂的疾病，涉及 DNA 突变，导致原癌基因和癌基因异常表达、肿瘤抑制基因失活以及表观基因组失调。肿瘤微环境（TME）包含多种细胞，如巨噬细胞、树突状细胞（DCs）、T 细胞等，它们与肿瘤细胞相互作用，影响肿瘤的发展和免疫反应。免疫疗法是一种有前景的癌症治疗方法，但目前面临诸多挑战，如对 TME 复杂性了解有限、缺乏有效的生物标志物以及可能引发自身免疫损伤等。功能筛选技术，尤其是基于 CRISPR 的筛选，为寻找新的免疫治疗靶点提供了新途径。
现代癌症免疫疗法的主要挑战
临床肿瘤免疫疗法研究广泛，但面临诸多难题。一方面，对 TME 复杂性、肿瘤异质性和免疫逃逸机制认识不足，导致免疫疗法疗效差异大，如 PD-1 疗法在不同肿瘤中的有效率为 15 - 50%。另一方面，缺乏明确的生物标志物评估疗效，且过度激活免疫反应会引发免疫相关不良事件（irAEs），如结肠炎、皮疹等。细胞疗法，如 CAR-T 免疫疗法，也存在免疫脱靶、靶向细胞毒性和 T 细胞耗竭等问题。因此，需要利用现代筛选技术寻找更精确的诊断生物标志物和治疗靶点。
癌症功能基因的筛选策略
功能基因的筛选和鉴定在癌症治疗中至关重要。正向筛选从特定表型出发，利用分子生物学技术鉴定候选基因，再进行功能验证，如在胶质瘤研究中发现核心转录因子 NR4A2 可增强免疫治疗效果。反向筛选则基于已知 DNA 序列信息，对基因进行处理和修饰，筛选目标表型后验证功能基因，常见的方法包括 cDNA 文库、RNA 干扰（RNAi）文库、CRISPR/Cas9 筛选等。
CRISPR/Cas9 介导的功能基因筛选系统
CRISPR/Cas9 系统是一种高效的基因编辑工具，由 Cas9 和单导向 RNA（sgRNA）组成。在癌症研究中，通过设计大量 sgRNA 靶向不同基因，可快速筛选出癌症驱动基因或肿瘤免疫调节因子。例如，在肿瘤免疫学研究中，利用 CRISPR/Cas9 系统构建的组合抗癌药物耐药实验（CADRE），揭示了肿瘤抑制基因与免疫耐药基因的相互作用。
CRISPR 技术不断创新，如 CLASH 平台，可创建更大、更通用的文库，用于精确大规模编辑。此外，dCas9 可诱导点突变，实现基因表达的可逆激活（CRISPRa）或抑制（CRISPRi）。通过 CRISPRa 筛选，已鉴定出多个驱动癌细胞对细胞毒性 T 细胞耐药的基因；利用 CRISPRi 筛选，也在多种癌症中发现了关键驱动基因和与免疫反应相关的基因。
传统 CRISPR 筛选方法存在局限性，如检测率低、缺乏综合细胞表型分析等。近年来，单细胞 CRISPR 筛选（scCRISPR）技术结合了 CRISPR 基因筛选和单细胞测序，可在单细胞分辨率下进行大规模基因扰动和丰富的表型分析，为解析复杂生物系统的基因调控机制提供了有力工具。
其他筛选系统
除 CRISPR/Cas9 系统外，还有其他筛选技术。cDNA 文库通过将 mRNA 逆转录为 cDNA 并导入宿主细胞，可筛选特定基因，如血清学分析表达 cDNA 文库（SEREX）可用于获取肿瘤特异性抗原。RNAi 可特异性敲除或关闭特定基因表达，但存在基因覆盖范围窄、表型变化不稳定和脱靶效应等问题。转座子是一类可移动的 DNA 序列，相关遗传筛选方法可用于鉴定肿瘤相关驱动基因，如使用 Sleeping Beauty（SB）系统和 PiggyBac（PB）系统在小鼠中进行突变筛选。将 CRISPR 筛选技术与 AAV 载体和 SB 转座子结合，可提高筛选的稳定性和准确性。
筛选新型癌症免疫治疗靶点的有效临床前模型
合适的临床前模型对免疫治疗药物的开发至关重要，但现有模型存在局限性，无法完全模拟人类肿瘤免疫的特征。
癌症免疫学中的体外筛选
在癌症免疫学研究中，体外筛选常用肿瘤细胞二维（2D）培养系统，可鉴定出与细胞生长密切相关的核心必需基因，为靶向治疗提供指导。但 2D 培养系统存在不足，缺乏癌症免疫周期（CIC）的复杂性和动态相互作用，影响细胞行为和免疫治疗反应。
三维（3D）体外模型可更好地模拟体内肿瘤微环境，如 3D 癌症球体和类器官。类器官是由干细胞衍生的 3D 微器官，具有自我增殖和自我组装能力，可用于研究肿瘤发生、发展和免疫反应。将免疫共培养技术应用于上皮癌研究，可诱导 T 细胞产生特异性免疫反应。此外，基于人类扁桃体开发的功能免疫器官分型系统，为研究人类适应性免疫提供了更准确的模型。
癌症免疫学中的体内筛选
体内筛选可研究肿瘤微环境中细胞间的相互作用和分子信号对免疫细胞的影响。常用的体内研究方法包括使用基因工程小鼠模型（GEMMs）和 CRISPR 技术进行基因敲除或敲入。通过在体内对免疫细胞进行 CRISPR 筛选，可鉴定出与肿瘤免疫相关的关键基因，如在急性髓系白血病（AML）和三阴性乳腺癌（TNBC）研究中发现的相关基因。
体内直接筛选是将编辑系统直接递送至荷瘤动物模型，检测基因表达差异。这种方法可利用内源性肿瘤组织和真实的肿瘤微环境，但也存在编辑效率低等问题。
CRISPR 在癌症免疫中的功能基因筛选
CRISPR 技术在研究不同类型免疫细胞的功能方面发挥着重要作用。
CRISPR/Cas9 介导的工程系统在多种免疫细胞中的应用
DCs 是强大的抗原呈递细胞。通过对 DCs 进行全基因组 CRISPR 筛选，可鉴定出调节肿瘤坏死因子（TNF）和影响 DCs 抗原呈递能力的关键基因。
单核细胞和巨噬细胞参与免疫反应和肿瘤免疫。对巨噬细胞进行 CRISPR 筛选，可识别调节其促炎极化的关键代谢基因，为基于巨噬细胞的肿瘤免疫治疗提供新靶点。
中性粒细胞中的病理性激活中性粒细胞（PMN-MDSCs）抑制免疫反应。CRISPR 筛选发现 PMN-MDSCs 表面的关键功能受体 CD300ld，阻断该受体可重塑免疫微环境，发挥抗肿瘤作用。
NK 细胞是免疫系统的重要组成部分。利用 CRISPR 技术可挖掘 NK 细胞与肿瘤细胞之间的特异性相互作用，鉴定出促进 NK 细胞肿瘤浸润的基因，为 CAR-NK 细胞治疗提供潜在靶点。
B 细胞在免疫反应中发挥重要作用。通过对 B 细胞进行 CRISPR 筛选，可揭示调节 B 细胞发育、激活和功能的关键基因。
T 细胞的高通量筛选
T 细胞在肿瘤免疫中至关重要，T 细胞免疫疗法逐渐改变癌症治疗格局，但 ACT 疗法存在疗效有限的问题。利用 CRISPR/Cas9 库筛选技术，可敲除与 T 细胞代谢相关的基因，鉴定出影响 CD8+ T 细胞寿命和功能的关键基因，如 REGNASE-1 基因。此外，通过对 T 细胞进行不同的 CRISPR 筛选，还发现了许多与 T 细胞分化、增殖和免疫治疗疗效相关的关键基因和蛋白，为增强癌症免疫治疗效果提供了新靶点和策略。
在人类原发性 T 细胞全基因组筛选中，构建优化的高滴度腺病毒包装的 dCas9-VP64，可成功高效地将 CRISPRa 系统递送至 T 细胞，进行大规模 CRISPRa 和 CRISPRi 筛选，鉴定出控制细胞因子分泌的基因网络，为未来癌症细胞疗法提供新靶点。
癌症免疫治疗靶点的筛选
CRISPR 筛选已广泛应用于癌症研究的多个方面，包括探索肿瘤细胞的增殖、代谢、耐药、转移和合成致死效应等。在肿瘤免疫反应研究中，通过 CRISPR 筛选可寻找影响抗肿瘤免疫的关键因素，为肿瘤免疫治疗提供新靶点。
在黑色素瘤和其他多种癌症细胞系中，利用 CRISPR 筛选技术鉴定出了影响免疫治疗的关键基因，如 APLNR、Fitm2 等，这些基因参与肿瘤免疫逃逸过程。在 ICI 治疗方面，通过对肺癌细胞系进行 CRISPR 筛选，揭示了 PD-L1 翻译的关键因子 eIF5B 和调节干扰素 -γR1 表达的 STUB1 基因，为理解癌症免疫治疗耐药机制提供了重要线索。
此外，研究还发现 MHC-I 抗原呈递的丧失或下调是癌症患者对免疫检查点治疗耐药的主要原因之一。利用双标记 CRISPR 筛选技术，可鉴定出调节 MHC-I 和 PD-L1 的基因，为提高免疫治疗效果提供了新方向。同时，针对肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和癌细胞逃避巨噬细胞吞噬的机制进行 CRISPR 筛选，也发现了许多关键基因，有助于深入理解肿瘤免疫微环境和开发新的治疗靶点。
癌症的发生发展与遗传变异和表观遗传因素密切相关。通过构建表观遗传 sgRNA 文库并进行体内 CRISPR 筛选，鉴定出了影响肿瘤免疫的表观遗传调节因子，如 Asf1a 和 KDM3A，为开发新的联合免疫治疗方案提供了理论依据。
挑战与展望
免疫逃逸是肿瘤耐药的关键因素，识别肿瘤免疫过程中的关键功能基因和下游调控机制是免疫治疗发展的重点。CRISPR 系统作为新兴的高通量筛选工具，在癌症生物学研究中广泛应用，但在生物模型选择、基因编辑、刺激方法、数据读取分析等方面存在局限性。例如，体外模型难以保证结果的真实性，免疫细胞数量有限增加了筛选难度，Cas9 蛋白可能引发免疫反应等。
尽管如此，CRISPR 筛选的结果有望转化为临床应用。如 PTPN2 和 PTPN1 基因的缺失被发现可促进抗肿瘤免疫，相关的双磷酸酶抑制剂已进入临床试验阶段。将药物筛选与 CRISPR 技术相结合，可提高临床转化效率。同时，整合多组 CRISPR 筛选数据和多组学数据，有助于发现新的免疫治疗靶点和预测免疫治疗反应的模型。随着 CRISPR 技术的不断发展，未来有望开发出更多针对复杂肿瘤亚型、解决肿瘤免疫过程多样性和克服患者间差异的治疗方法，为癌症患者带来更多希望。
