揭示 SLC25A38 在维持线粒体维生素 B6活性形式（PLP）积累中的关键作用及其临床意义

许多关键蛋白需维生素 B6的活性形式磷酸吡哆醛（PLP）作为辅因子，但哺乳动物线粒体中 PLP 水平的调控机制不明。研究人员通过全基因组 CRISPR 干扰筛选和代谢组学研究，发现 SLC25A38 对线粒体 PLP 积累至关重要，这为先天性铁粒幼细胞贫血的病理研究提供了新视角。

　　在细胞的代谢过程中，维生素 B₆扮演着极为重要的角色，其活性形式磷酸吡哆醛（PLP）是众多关键蛋白发挥作用的必需辅因子。在氨基酸代谢、一碳代谢、多胺合成、红细胞生成以及神经递质代谢等重要生理过程里，都离不开 PLP 的参与。然而，令人遗憾的是，尽管约三分之一的哺乳动物 PLP 依赖酶定位于线粒体，但线粒体中 PLP 水平的调控机制却一直是个未解之谜。这一知识空白严重阻碍了我们对相关生理过程和疾病病理的深入理解，比如先天性铁粒幼细胞贫血（CSA）等疾病，其发病机制可能与线粒体 PLP 水平异常密切相关。为了填补这一空白，来自国外多个研究机构的研究人员，包括 The Picower Institute for Learning and Memory、Department of Brain and Cognitive Sciences 等，开展了一系列深入研究 。
研究人员采用了全基因组 CRISPR 干扰（CRISPRi）筛选和细胞器代谢组学等前沿技术。在实验中，他们以 K562 人红白血病细胞为主要研究对象，这种细胞对 PLP 依赖的代谢途径高度依赖，适合用于探究相关机制。通过精心设计的实验流程，研究人员最终发现线粒体内膜蛋白 SLC25A38 是线粒体 PLP 的重要调节因子。
研究结果具体如下：

1. 全基因组遗传筛选：研究人员通过构建缺乏吡哆醇和白蛋白结合 PLP 的培养基，模拟低维生素 B₆环境，对 K562 细胞进行全基因组 CRISPRi 筛选。结果发现，SLC25A38 在低维生素 B₆条件下表现为条件必需基因，其在维持细胞增殖方面起着关键作用。同时，参与细胞质 B₆补救途径的关键酶基因（如 PDXK、PNPO 和 PROSC）以及一些已知的 PLP 依赖酶基因（如 SHMT2、GOT2 和 ODC1）在低维生素 B₆条件下也表现出条件必需性 。
2. SLC25A38 缺失的影响：进一步研究发现，SLC25A38 缺失会导致线粒体 PLP 特异性耗尽，而细胞整体的 PLP 水平不受影响。在低维生素 B₆生长条件下，SLC25A38 基因敲除的 K562 细胞和 Jurkat 细胞均出现明显的增殖缺陷。这表明 SLC25A38 在维持线粒体 PLP 水平和细胞在低维生素 B₆环境下的正常增殖中具有不可或缺的作用 。
3. 功能验证与机制研究：研究人员通过表达野生型 SLC25A38 和其酵母同源物 Hem25p，成功挽救了 SLC25A38 基因敲除细胞的增殖缺陷和线粒体 PLP 水平，而表达 SLC25A39 或 CSA 患者变异体则无法达到同样效果。对 SLC25A38 底物结合位点突变体的研究表明，这些突变体无法挽救细胞的增殖缺陷和线粒体 PLP 水平，说明 SLC25A38 维持线粒体 PLP 水平的功能与其底物结合和转运活性密切相关。通过添加同位素标记的吡哆醇（D3-PN）追踪实验发现，SLC25A38 基因敲除细胞无法将标记的 PLP 积累到线粒体中，进一步证实了 SLC25A38 在线粒体 PLP 积累过程中的关键作用 。
4. 代谢变化与机制探究：在低维生素 B₆条件下，SLC25A38 基因敲除细胞的线粒体甘氨酸合成通过 SHMT2 途径受损，导致细胞内甘氨酸水平降低，一碳代谢异常，进而影响细胞增殖。研究还发现，SLC25A38 基因敲除细胞中多种 PLP 依赖酶的底物积累，这表明 SLC25A38 缺失导致线粒体 PLP 水平降低，进而影响了这些酶的活性。此外，SLC25A38 基因敲除细胞在低维生素 B₆条件下的呼吸作用也受到影响，表现为氧消耗率降低，而表达野生型 SLC25A38 可以恢复呼吸功能 。

研究结论和讨论部分指出，SLC25A38 在维持线粒体 PLP 的生理水平方面发挥着至关重要的作用，其功能缺失会导致线粒体 PLP 水平下降，进而影响多个 PLP 依赖的线粒体代谢途径，最终影响细胞增殖和生理功能。这一发现不仅为理解先天性铁粒幼细胞贫血等疾病的病理机制提供了新的视角，也为开发相关疾病的治疗策略奠定了基础。例如，通过调节维生素 B₆水平或干预 SLC25A38 相关的代谢途径，可能为 CSA 患者提供新的治疗方法。同时，研究还发现 SLC25A38 在高维生素 B₆条件下似乎并非必需，暗示存在其他补偿机制，这为后续研究指明了方向。未来的研究可以进一步探索这些补偿机制，寻找与 SLC25A38 功能冗余的蛋白，从而为相关疾病的治疗提供更多潜在的靶点。 总之，该研究成果发表在《Nature Communications》上，为生命科学和医学领域对线粒体维生素 B₆代谢和相关疾病的研究开辟了新的道路，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。

研究人员开展这项研究主要用到了以下关键技术方法：

1. CRISPRi 筛选技术：利用全基因组 CRISPRi 文库对 K562 细胞进行筛选，确定在低维生素 B₆条件下的条件必需基因。通过计算基因分数（GS）和差异基因分数（dGS），评估每个基因在不同维生素 B₆条件下对细胞增殖的影响 。
2. 代谢组学技术：采用液相色谱 - 质谱（LC-MS）技术分析细胞和线粒体中的维生素 B₆代谢物水平，包括 PLP、PMP 等。同时，运用亲水相互作用液相色谱 - 质谱（HILIC LC-MS）和气相色谱 - 质谱（GC-MS）等技术对极性代谢物进行分析，以探究 SLC25A38 缺失对细胞代谢的影响 。
3. 基因编辑技术：运用 CRISPR/Cas9 系统构建 SLC25A38、SLC25A39 等基因敲除细胞系，通过转染、筛选和单克隆挑选获得稳定的基因敲除细胞株，用于研究基因缺失对细胞表型和功能的影响 。