新型多重免疫分析方法助力疟疾疫苗研究：精准检测，开拓免疫分析新视野

疟疾严重威胁全球健康，为评估 R21/MatrixM?疟疾疫苗免疫反应，研究人员开发并验证一种多重免疫分析方法。结果显示该方法稳健、特异性强、动态范围广，与单重 ELISA 检测结果相关性良好，有助于疟疾疫苗免疫研究。

　　疟疾，一直是全球公共卫生领域的 “顽固敌人”，每年都无情地夺走数十万人的生命，尤其是在撒哈拉以南非洲地区，无数儿童和孕妇深受其害。目前，R21/MatrixM?（R21/MM）和 RTS,S/AS01 是世界卫生组织推荐使用的仅有的两种疟疾疫苗，它们主要针对疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）感染的红细胞前期。然而，在评估 R21/MM 疫苗免疫反应时，传统的单一抗原检测方法存在局限性，无法全面了解疫苗激发的免疫应答，且在面对儿科等样本量有限的情况时更是捉襟见肘。为了突破这些困境，来自英国牛津大学詹纳研究所（Jenner Institute, University of Oxford）的研究人员开展了一项意义重大的研究。

他们开发并验证了一种多重免疫分析方法，可同时测量针对 R21 疫苗中多个抗原的抗体水平，包括环子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）的 NANP 重复区域、CSP C - 末端区域、全长 R21 和乙肝表面抗原（HBsAg）。研究结果表明，该多重免疫分析方法表现出良好的稳健性和特异性，具有较宽的动态范围。并且，该方法检测的 NANP₆ IgG 抗体水平与之前牛津大学 R21/MM 临床试验中使用的单重 ELISA 检测结果之间存在很强的线性关系。这一研究成果发表在《npj Vaccines》上，为疟疾疫苗的免疫分析提供了更全面、精准的工具，有助于深入了解疫苗的免疫机制，推动疟疾疫苗的进一步优化和发展 。

研究人员开展研究时用到的主要关键技术方法包括：首先，选用来自三项 R21 疫苗临床试验的血清和血浆样本，以及来自英国受控人类疟疾感染（CHMI）研究的样本用于方法开发和验证；其次，采用 Meso Scale Discovery（MSD）公司开发的 4 - 斑点、96 孔板结合电化学发光（ECL）检测系统的多重免疫分析技术，检测血浆或血清样本中抗原特异性 IgG；最后，运用统计分析方法，如计算变异系数（% CV）评估实验的重复性，使用 Spearman 秩相关系数分析不同检测方法间的相关性等。

下面来详细看看研究结果：

• 初始方法开发：MSD 公司利用 120 份来自不同临床试验的样本进行初始方法开发，确定了抗原与 BSA 的结合方式、样本最佳稀释比例、标准曲线材料及质控（QC）样本的制备等。结果显示，该方法在抗原包被均匀性、特异性和重复性方面表现良好。
• 内部验证：在牛津大学詹纳研究所进行的内部验证中，研究人员从多个角度评估了该方法的性能。在研究实验室间变异性时，发现标准曲线和 QC 样本在不同实验室间存在一定变异，但临床样本测量结果在两个实验室间呈正相关；研究批内变异性时，比较同一天同一操作员运行的两个板的数据，发现标准曲线和 QC 样本的变异在可接受范围内，临床样本的平均变异为 2.5% CV；研究批间变异性时，比较同一操作员在不同天运行的板的数据，标准曲线、QC 样本和临床样本的变异均在可接受范围；研究操作员间变异性时，不同操作员运行的板的数据显示，标准曲线变异较小，QC 样本和临床样本变异在可接受范围内。
• 探究多重 MSD 的阴性阈值：研究人员使用 58 份来自英国未感染过疟疾的志愿者的预接种样本，计算出 NANP、C - 末端和全长 R21 的阴性阈值，但在本研究数据中未将其作为截断值使用。
• 从标准化 NANP₆ ELISA 到 MSD 的桥接研究：通过对两个不同队列（布基纳法索婴儿队列和马里婴儿队列）的研究，比较单重 NANP₆ ELISA 和多重 MSD 分析方法，发现两种方法高度相关。同时，研究还计算了两种方法的动态范围，多重 MSD 分析方法的动态范围为 2250，单重 ELISA 的动态范围为 37。

在研究结论和讨论部分，该多重免疫分析方法符合国际人用药品注册技术协调会（ICH）等监管机构制定的精准度、线性、特异性、稳健性等标准，可同时测量多个 R21 疫苗抗原的抗体水平，适用于样本量有限的临床试验，为疟疾疫苗免疫反应评估提供了有力工具。然而，该方法也存在一些局限性，如样本稀释度高、成本高、数据管理要求高，且添加抗原需重新验证等。尽管如此，该方法在大规模临床试验中仍具有重要价值，能够支持对 R21 疫苗的进一步免疫学研究，为疟疾防控带来新的希望。