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为解决利用非糖碳源进行生长偶联策略时代谢数据不足等问题，研究人员以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 为对象，研究对香豆酸（p-CA）到谷氨酰胺的生物转化。结果表明 PP_0897 有额外功能，还发现代谢模型存在局限。该研究为生物制造提供了重要参考。
在生物制造领域，利用可再生碳源进行微生物发酵生产高价值产品是研究热点。然而，目前使用非糖碳源时面临诸多挑战。基因组规模代谢模型（GSMM）虽能用于设计基因删除集以实现生长偶联和提高菌株性能，但针对非标准碳源的代谢数据不完整，导致难以构建准确模型和确定可行设计。此外，非糖碳源的底物毒性也增加了菌株工程的难度。在此背景下，为了突破这些困境，来自劳伦斯伯克利国家实验室（Lawrence Berkeley National Laboratory）的研究人员开展了相关研究。
研究人员以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 为研究对象，聚焦于木质素衍生的非糖碳源对香豆酸（p-CA）的生物转化。他们致力于探究四基因删除设计对从 p-CA 到谷氨酰胺（一种有用的生物制造中间体）转化过程的影响，并进一步研究谷氨酰胺转化为靛蓝素（indigoidine）的情况。
研究结果具有重要意义。一方面，明确了 PP_0897 基因除了作为富马酸水合酶的功能外，还参与了细胞的其他活动，这为深入理解细胞代谢机制提供了新视角。另一方面，发现基于 GSMM 的设计存在局限性，通过蛋白质组学数据构建的特定背景模型能更准确地反映代谢情况，为优化菌株设计提供了更可靠的依据。该研究成果发表在《npj Systems Biology and Applications》上，为生物制造领域利用非糖碳源提供了重要的理论和实践指导。
研究人员采用了多种关键技术方法。在菌株构建方面，运用重组工程技术构建基因组删除突变体和进行启动子替换。分析代谢物时，使用 HPLC 和 LC-MS 技术定量 p-CA、谷氨酰胺、谷氨酸等代谢物。研究蛋白质表达变化则借助 Shotgun 蛋白质组学分析。此外，利用约束模型和模拟方法，如通量平衡分析（FBA）、双稳健性分析等，对代谢网络进行研究。
下面详细介绍研究结果：
- 完成 P-CA / 靛蓝素切割集及调节 PP_0897 基因表达对菌株生长、生产和蛋白质组响应的影响：通过实验成功删除了生成完整切割集所需的四个基因，发现 PP_0897 基因单独删除不影响生长，但完全删除该切割集导致菌株生长缓慢甚至无法生长和产生最终产品。调节 PP_0897 基因表达后，部分菌株能够生长并产生靛蓝素，且特定菌株的谷氨酸池增加，符合模型预测。蛋白质组学分析表明，PP_0897 基因表达变化影响了多种蛋白质的丰度，但具体机制尚待进一步研究。
- 特定背景的 GSMM 解释了高度受限的设计空间：基于蛋白质组学数据生成的特定背景模型显示，富马酸水合酶（FUM）反应的通量范围狭窄，且生长、FUM 反应和生产之间存在权衡关系。双敏感性分析预测了一个特定的 FUM 通量点，可实现严格的生长偶联生产谷氨酰胺，这解释了为什么某些菌株无法通过适应性实验室进化恢复生长和生产。
- 代谢物补充无法恢复完整切割集菌株的 P-CA 分解代谢：向培养基中添加苹果酸未能恢复缺失 PP_0897 基因菌株在含 p-CA 培养基中的生长，说明该生长缺陷不能仅用苹果酸营养缺陷来解释。通过 BIOLOG 表型微阵列分析发现，某些代谢物（如 D - 丙氨酸、L - 乳酸等）可在一定程度上恢复菌株生长，但 p-CA 的降解速率仍较低。进一步的蛋白质组学分析表明，缺失 PP_0897 基因导致菌株对 p-CA 的代谢反应不佳，生长偶联无法维持。
研究结论和讨论部分强调了该研究的重要意义。富马酸和富马酸水合酶在连接中心代谢和许多未被基因组规模代谢模型捕获的细胞功能中起着关键作用。双敏感性分析为评估基因干预对生长和生产的影响提供了有效方法，揭示了 PP_0897 基因删除导致菌株生长和生产受限的原因。此外，研究还提出了评估切割集的严格标准，为后续生物制造中菌株设计提供了重要参考，有助于优化基于可再生碳源的生物转化过程，推动生物制造领域的发展。
