Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein：为靶向 PP2A 的药物研发点亮新灯塔

蛋白磷酸酶 2A（PP2A）的支架亚基 PR65 与小分子激活剂 ATUX-8385 的相互作用研究至关重要。研究人员运用纳米孔径光镊（NOT）等技术开展研究，测定了结合动力学和结构影响。该成果为理解 PP2A 激活机制及药物研发提供了关键依据，意义重大。

　　在生命的微观世界里，细胞如同一个精密运转的工厂，各种生物分子相互协作，维持着生命的正常活动。其中，蛋白磷酸酶 2A（Protein Phosphatase 2A，PP2A）扮演着极为重要的角色，它参与调节细胞增殖、维持细胞内环境稳定以及调控细胞信号通路。然而，当 PP2A 的调控出现异常时，就如同工厂的生产线出现故障，会引发一系列严重的问题，与多种癌症、阿尔茨海默病以及慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病紧密相关。

为了修复这条 “故障生产线”，开发针对 PP2A 的治疗方法成为医学研究领域的重要目标。在众多研究方向中，通过小分子激活剂重新激活 PP2A 的策略备受关注。在这样的背景下，来自加拿大维多利亚大学、英国剑桥大学、美国石溪大学等多个研究机构的研究人员展开了深入研究，致力于揭示小分子激活剂与 PP2A 关键亚基的作用机制，为相关疾病的治疗带来新的希望 。他们的研究成果发表在《npj Biosensing》杂志上。

研究人员运用了多种关键技术方法来探索小分子激活剂与 PP2A 的相互作用。其中，纳米孔径光镊（nanoaperture optical tweezers，NOT）技术发挥了核心作用，它能够在无需对蛋白质进行标记或 tethering 的情况下，对单个蛋白质及其相互作用进行研究。此外，研究还结合了全原子分子动力学模拟（all-atom molecular dynamics simulations）、纳米差示扫描荧光法（nano differential scanning fluorimetry，nanoDSF）、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）以及荧光偏振各向异性（fluorescence polarization anisotropy）等技术，从不同角度对分子间的相互作用进行全面分析。

下面来看具体的研究结果：

• ATUX-8385 结合的结构影响：NOT 实验结果：研究人员利用自制的光镊装置和胶体法制备的双纳米孔（DNH）进行实验。通过监测光透过强度的变化来捕获蛋白质，实验发现，在有小分子激活剂 ATUX-8385 存在时，PR65 蛋白的透射强度会在两个水平之间波动，这表明蛋白质发生了构象变化。而且，实验观察到结合 ATUX-8385 后蛋白质的散射信号电压增大，意味着蛋白质发生了延伸。通过改变 ATUX-8385 的浓度重复实验，进一步确定较高透射水平对应蛋白质与配体的结合状态。
• 分子模拟：由于此前缺乏 ATUX-8385 在 PR65 上结合位点的结构数据，研究人员进行了一系列对接模拟。结果发现了一个新的结合位点，该位点包含 HEAT 重复序列 4 和 5 的内部螺旋（4_i和 5_i）以及 HEAT 重复序列 5 和 6 的外部螺旋（5_c和 6_c）。随后的分子动力学模拟显示，ATUX-8385 与该位点结合后，在大多数模拟中稳定了 PR65 的延伸构象，这与 NOT 实验结果相互印证。
• 蛋白质结合动力学观察：NOT 单分子测量：对捕获信号进行 3Hz 低通滤波后，研究人员通过隐马尔可夫方法（Hidden Markov Method，HMM）将信号分段并拟合为阶跃函数，识别出蛋白质的结合和未结合状态。通过分析结合和未结合状态下的停留时间累积分布函数（Cumulative Distribution Functions，CDFs），确定了结合和解离速率常数。实验结果表明，ATUX-8385 与 PR65 的结合符合 1:1 结合模型，在 20μM ATUX-8385 浓度下，计算得到的解离常数为 13.6±2.5 μM。
• SMAP 与 PR65 结合的额外表征：研究人员运用 nanoDSF、¹⁹F NMR 和荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）等技术对 ATUX-8385 与 PR65 的结合进行了进一步研究。nanoDSF 实验显示，ATUX-8385 的存在使 PR65 的熔解温度升高，表明两者发生了结合且蛋白质结构得到了轻微稳定；¹⁹F NMR 实验通过检测小分子的信号强度和¹⁹F 弛豫率变化，证实了 ATUX-8385 与 PR65 的结合；FP 实验利用 ATUX-8385 的荧光特性，通过滴定不同浓度的 PR65，计算得到平衡解离常数 K_D为 9.4±1.4 μM，与 NOT 实验结果相符。

综合上述研究，研究人员成功鉴定出 ATUX-8385 在 PR65 上的新结合位点，明确了其结合对 PR65 结构动力学的影响，测定了结合动力学参数，为理解 PP2A 的激活机制提供了重要线索。同时，研究中运用的 NOT 技术与其他多种技术相结合的方法，为研究蛋白质与小分子相互作用提供了新的思路和手段，有助于推动基于 PP2A 靶点的药物研发，为相关疾病的治疗开辟新的道路，在生命科学和健康医学领域具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。