揭秘人体免疫防线：CD4+与 CD8+调节性 T 细胞的独特使命

免疫系统如何维持自我耐受同时抵御外来抗原一直是免疫学难题。为探究此，研究人员利用人扁桃体类器官系统，敲除 FOXP3 和 GZMB 基因研究 CD4+和 CD8+调节性 T 细胞（Treg）作用。结果发现二者在调控免疫和预防自身免疫病中有不同作用，为相关研究提供新思路。

　　在免疫学的神秘世界里，免疫系统就像一位智慧的守护者，精准地区分着 “自我” 和 “非我”。自 1901 年保罗?埃尔利希提出免疫系统如何维持对自身抗原的耐受，同时又能对外来抗原发起有力攻击这个关键问题后，科学家们就踏上了漫长的探索之旅。起初，研究之路并不平坦，但随着对 B 细胞耐受的分析以及表达转录因子 FOXP3 的 CD4⁺T 细胞亚群的发现，免疫学研究迎来了新的曙光。近年来，人们又发现了小鼠体内一小部分 CD8⁺T 细胞在控制自身反应性方面的重要作用，然而，这两种主要的调节性 T（T_reg）细胞的具体功能，仍如同隐藏在迷雾中的宝藏，等待着科学家们去挖掘。

为了揭开这层神秘的面纱，来自斯坦福大学（Stanford University）的研究人员展开了深入研究。他们利用人扁桃体类器官系统，通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，敲除与 CD4⁺T_reg和 CD8⁺T_reg细胞功能相关的关键基因 FOXP3 和 GZMB，以此来探究它们在控制自身反应性 T 和 B 淋巴细胞中的作用。研究结果意义重大，不仅揭示了 CD4⁺T_reg和 CD8⁺T_reg细胞在调节细胞和体液免疫反应、预防自身免疫病方面有着独特且互补的作用，还为研究自身免疫病的发病机制和治疗策略提供了新的视角和方向。该研究成果发表在《Nature Immunology》杂志上，为免疫学领域的发展添上了浓墨重彩的一笔。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，通过构建靶向 FOXP3 和 GZMB 基因的 gRNA，与 Cas9 蛋白形成核糖核蛋白（RNP）复合物，转染人扁桃体 T 细胞实现基因敲除；其次利用流式细胞术（Flow cytometry），对不同细胞亚群进行标记和分析，检测基因敲除效率、细胞表面标志物及细胞内蛋白表达情况；还运用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体水平，以及生物膜干涉技术（Biolayer interferometry）测定抗体结合亲和力 。研究样本来自斯坦福大学 IRB 批准的扁桃体和血液样本，涵盖不同年龄段和性别的志愿者。

研究结果

1. 扁桃体和血液中 T_reg细胞的差异：研究人员对比了扁桃体和外周血中 CD4⁺T_reg和 CD8⁺T_reg细胞的频率和表型。发现扁桃体中 FOXP3⁺CD4⁺T_reg细胞频率显著高于血液，且部分扁桃体 CD4⁺T_reg细胞 CD25 表达水平低，同时扁桃体中 CD4⁺CXCR5⁺FOXP3⁺滤泡调节性 T 细胞比例也更高。而 CD8⁺T_reg细胞在扁桃体和血液中的 KIR 表达频率相似，但血液中的 CD8⁺T_reg细胞颗粒酶 B（Granzyme B）表达水平更高。
2. 基因敲除效果及炎症表型：运用 Cas9-RNPs 实现高效基因敲除，FOXP3 基因敲除后，其在扁桃体 T 细胞内的表达从 14.7% 降至 0.91%；GZMB 基因敲除后，KIR⁺CD8⁺T 细胞内颗粒酶 B 表达显著降低，敲除效率达 95%。基因敲除后的扁桃体类器官呈现炎症表型，CD4⁺和 CD8⁺T 细胞中表达激活标记 CD38 和共刺激分子 CD27 的细胞比例增加，GZMB 基因敲除的类器官中活化的滤泡辅助性 T（T_FH）细胞比例显著升高，同时生发中心 B 细胞和浆母细胞比例也增加。
3. 敲除后自身抗体产生差异：在敲除 FOXP3 基因的扁桃体类器官中，刺激后产生了针对多种自身抗原的自身抗体，且抗原特异性抗体亲和力显著增加；而敲除 GZMB 基因的扁桃体类器官，自身抗体产生变化不明显。进一步研究发现，流感减毒活疫苗（LAIV）刺激后，FOXP3 基因敲除的扁桃体类器官产生的自身抗体水平比野生型高 7 倍，且多数高自身抗体产生的敲除类器官来自女性供体，而 GZMB 基因敲除的扁桃体类器官分泌的自身抗体极少 。
4. 敲除后自身反应性 B 细胞和 T 细胞的变化：FOXP3 基因敲除的扁桃体类器官在刺激后，自身反应性 B 细胞显著扩增；GZMB 基因敲除则对自身反应性 B 细胞频率影响较小。在自身反应性 T 细胞方面，GZMB 基因敲除的扁桃体类器官中，自身特异性 CD8⁺T 细胞和 CD4⁺T 细胞频率显著增加，且多数扩增的自身反应性 CD4⁺T 细胞来自女性供体，而 FOXP3 基因敲除对 CD4⁺T 细胞特异性影响不大。
5. 对抗体亲和力的影响及性别差异：敲除 FOXP3 基因可显著提高抗体的半衰期（t_1/2），表明其表达的 T 细胞能限制抗体亲和力；敲除 GZMB 基因对抗体亲和力影响较小。此外，研究还发现女性扁桃体 B 细胞中自身反应性 B 细胞频率更高，且在 FOXP3 基因敲除的刺激扁桃体类器官中，自身抗体产生与年龄相关，40 岁以上供体的自身抗体水平更高。

研究结论与讨论

该研究通过构建人扁桃体类器官自身免疫模型，揭示了 CD4⁺T_reg和 CD8⁺T_reg细胞在调节自身免疫中的不同作用。CD4⁺T_reg细胞主要通过直接与 B 细胞相互作用调节自身抗体产生，而 CD8⁺T_reg细胞则是控制 T 细胞耐受性的主要因素，尤其是对自身反应性 CD4⁺T 细胞的调控。这些发现与小鼠模型及临床患者中 CD4⁺和 CD8⁺T_reg细胞缺陷的观察结果相符。

这项研究为深入理解自身免疫病的发病机制提供了重要依据，也为开发新的治疗策略指明了方向。未来进一步探索扁桃体类器官模型，有望挖掘更多潜在机制，并转化为临床治疗方法，为广大自身免疫病患者带来新的希望。