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推荐阅读！本文利用饱和基因组编辑（SGE）与 CRISPR 介导的同源定向修复（HDR）技术，对 TP53 进行深度突变扫描。研究涵盖超 94.5% 的癌症相关 TP53 错义突变，揭示突变功能多样性，为临床解读 TP53 变异、指导个性化癌症治疗及遗传咨询提供关键依据。
### 研究背景
p53 作为关键的肿瘤抑制因子，通过诱导细胞周期停滞、衰老和凋亡等机制，抑制癌细胞的增殖。TP53 基因突变在约一半的癌症中出现，若为种系突变，还会引发 Li-Fraumeni 综合征。多数 TP53 突变为错义突变，已识别超 2000 种，大多集中于 DNA 结合域（DBD）。虽然 TP53 突变具有预后意义，但因其突变景观复杂，将其纳入临床决策面临挑战。深入了解不同 TP53 突变的功能影响，对个性化治疗和遗传咨询至关重要。此前研究存在局限性，如酵母系统缺乏完整 p53 调控网络，基于 cDNA 的人类细胞筛选存在非生理表达等问题。而 CRISPR - Cas9 介导的基因编辑技术，尤其是饱和基因组编辑（SGE），为研究 TP53 突变功能提供了更有效的手段。
研究方法
- 构建等基因模型：选用 HCT116 结直肠癌细胞系，其 TP53 基因野生型（WT）且具有典型 p53 反应。通过改进 SGE 技术，使一个 TP53 等位基因失活，并利用含筛选标记的 LoxP - Stop - LoxP（LSL）盒可逆沉默另一个等位基因的表达，构建 HCT116 LSL/Δ 细胞系，用于后续的定点突变研究。
- 设计 TP53 变异文库：以人类 Ensembl 基因组修订版 96（GRCh38）中的 WT TP53 序列为模板，针对外显子 5 - 8 及部分侧翼内含子序列进行计算机诱变。通过单核苷酸替换、添加双核苷酸和三核苷酸变异、插入和缺失等操作，构建包含 9225 个变异的文库，涵盖约 94.5% 的癌症相关 TP53 错义突变。
- 生成 CRISPR - HDR 供体载体：针对不同区域的突变，PCR 扩增或合成相应的同源臂，克隆到载体中构建供体载体。如针对 R175 位点及外显子 5、6、7、8 分别构建了不同的 HR700 供体载体。同时，构建用于递送 Cas9 和单导向 RNA（sgRNA）的质粒。
- 建立筛选细胞系：对 HCT116 和 H460 细胞系进行基因编辑，构建含有特定突变的细胞系。如通过转染特定的 sgRNA 和供体载体，获得 HCT116 LSL/ΔIn5、HCT116 LSL/ΔIn5 + 7 和 H460 LSL/Δ/Δ 等细胞系，并对其进行筛选和验证。
- 处理突变细胞和细胞文库：将构建好的突变细胞和细胞文库用不同的试剂处理，如 Mdm2 抑制剂 Nutlin - 3a（N3a）、其他 Mdm2 和 Mdmx 抑制剂、DNA 损伤剂（如辐射、5 - 氟尿嘧啶）、营养剥夺剂（如饥饿、葡萄糖或谷氨酰胺剥夺）以及 p53 激活化合物（如 APR - 246、ZMC1）等，观察细胞的反应。
- 基因组 DNA 和 cDNA 分析：提取突变细胞和细胞文库的基因组 DNA 和 cDNA，通过 PCR 扩增、测序等技术分析变异情况。计算相对频率、富集分数（ES）和相对适应性分数（RFS），以评估突变的功能影响。同时，对 cDNA 进行分析，检测 mRNA 的剪接情况。
研究结果
- 等基因模型验证：向 HCT116 LSL/Δ 细胞系引入一系列 TP53 变异，包括常见癌症突变、无义突变和 WT 对照。结果显示，供体整合成功率为 75.9%，特异性突变率为 56.4%。N3a 处理后，WT 和错义突变体中 p53 蛋白表达水平可比，且 N3a 能诱导 p21/CDKN1A 表达和 p53 特征性信号。实时活细胞成像证实，p53 功能丧失（LOF）突变会削弱 N3a 对细胞生长的抑制作用。此外，研究未观察到错义变异的增益功能（GOF）效应，不过体内连续传代后，如 R175H 突变体出现了 GOF 相关的迁移、侵袭和转移能力增强的现象。
- R175 突变扫描：对 R175 密码子进行突变扫描，构建包含 27 种不同变异的文库并转染 HCT116 LSL/Δ 细胞。N3a 处理后，变异分布发生时间和剂量依赖性变化，不同 Mdm2 和 Mdmx 抑制剂处理结果相似。错义变异可分为 LOF、部分 LOF（pLOF）和 WT - 样变异三类。所有癌症中复发的 R175 变异均属于 LOF 和 pLOF 类别，且未发现 R175 错义变异显著增强细胞适应性的 GOF 表型。不同 p53 激活刺激下，R175 变异的适应性效应与 N3a 处理相似，但 N3a 因对 p53 通路的选择性，能更有效区分 p53 变异的功能差异。此外，研究发现 p53 激活化合物 APR - 246 和 ZMC1 无法有效重新激活 R175 错义突变体，且不同 R175 变异的反应动力学存在差异，部分变异通过凋亡减少适应性，部分则通过细胞周期停滞实现。
- p53 DBD 深度突变扫描：对 p53 DBD 进行深度突变扫描，涵盖 9225 个变异。N3a 处理后，变异分布改变，通过将 ES 标准化为 RFS，发现移码变异和无义突变的 RFS 值较高，多数错义变异显示出不同程度的功能受损，而大多数内含子变异的 RFS 值为负，表明其保留了肿瘤抑制活性。将 RFS 值映射到蛋白质结构上，发现与 DNA 结合表面和疏水核心相关的残基对突变更敏感。RFS 值与癌症患者中的突变频率和进化保守性相关，高 RFS 值的变异在肿瘤发生过程中受到正选择。利用 ClinVar 变异评估 RFS 对变异致病性的分类能力，结果显示 RFS 能有效区分致病性和良性变异，达到较高的精度和召回率。
- CRISPR - 基于深度突变扫描的优势：与之前基于 cDNA 过表达的研究相比，CRISPR 筛选能更好地分离正负对照，清晰区分癌症相关错义突变和非癌症相关单核苷酸变异（SNV）。部分在 cDNA 筛选中被归类为 WT - 样的错义变异，在 CRISPR 筛选中被重新鉴定为 LOF 变异，这些变异在小鼠模型中具有致瘤性，且其热稳定性介于 LOF 变异和 WT - 样变异之间，可能通过药物干预恢复功能。
- 广泛的剪接改变和 NMD：CRISPR - 基于的筛选发现了许多之前被忽视的剪接改变突变。如 55 个之前报道的剪接改变 TP53 变异在 N3a 处理下富集，显示出 LOF 特征。一些位于外显子边界附近的变异，如 G187、E224、V225 和 S261 等，在 cDNA 筛选中被误分类为 WT - 样，但在 CRISPR 筛选中因剪接缺陷被鉴定为 LOF。此外，还发现一些内含子区域的突变会影响剪接，导致 LOF。针对部分剪接缺陷变异，如 g.7675202A>T（L137Q），使用剪接转换寡核苷酸（SSOs）可纠正剪接缺陷，恢复 p53 功能。
研究结论
本研究利用 CRISPR - HDR 进行的 TP53 深度突变扫描，全面注释了 TP53 变异的功能。研究发现约 20% 之前被分类为良性的错义变异实际上是 LOF 变异，这些变异可能通过药物干预恢复功能。同时，研究揭示了剪接改变突变的重要性，并证明了使用 SSOs 纠正剪接缺陷的潜力。此外，研究未发现错义突变比无义突变具有适应性优势，强调了 GOF 效应需要二次改变。该研究为 TP53 突变数据库增添了重要信息，有助于临床变异解读，推动遗传咨询和个性化癌症治疗的发展。
