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A 型血友病（HA）由凝血因子 VIII（FVIII）突变引起，当前治疗存在局限。研究人员通过构建功能增强的 FVIII 变体，插入患者来源 iPSCs 的 AAVS1 位点。结果显示，可提高 FVIII 活性和稳定性，为 HA 治疗提供新策略。
在医学领域，血友病 A（HA）是一种常见的遗传性出血性疾病，它如同隐藏在身体里的定时炸弹，时刻威胁着患者的健康。HA 是由位于 X 染色体上的凝血因子 VIII（FVIII）基因突变所导致 。在人体正常的凝血过程中，FVIII 扮演着至关重要的角色，它与活化的 FIX 结合形成十酶复合物，进而激活 FX，启动凝血的正反馈循环。然而，目前针对 HA 尚无根本性的治愈方法。严重 HA 患者（FVIII 活性 < 1%）极易出现慢性肌肉骨骼疾病和内出血，需要每隔 2 到 3 天使用重组 FVIII 进行昂贵的终生治疗，这给患者及其家庭带来了沉重的负担。
为了攻克这一医学难题，来自韩国延世大学医学院等机构的研究人员展开了深入研究。他们致力于探索一种新的治疗策略，旨在提高 FVIII 的功能，为 HA 患者带来新的希望。最终研究成果发表于《Experimental & Molecular Medicine》杂志。
研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因编辑技术，利用 CRISPR/Cas9（D10A）切口酶将功能增强的 FVIII 基因精准地插入到患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）的 AAVS1 位点 。iPSCs 具有独特的特性，它可以由体细胞通过诱导重编程因子（如 OCT4、SOX2、KLF4 和 c-MYC）产生，并且能够分化为任何类型的细胞，这为细胞治疗提供了绝佳的细胞来源。此外，研究人员还运用了细胞培养、RNA 分析、蛋白质检测以及动物实验等技术手段，对基因编辑后的细胞和实验动物进行全面的检测和评估。
下面来看具体的研究结果：
- 构建并筛选供体质粒：为解决 EC 分泌的 FVIII 治疗效果不佳的问题，研究人员设计了四种供体质粒，分别表达不同的 FVIII 变体。通过对这些变体的活性和稳定性检测，发现 F309S/E1984V（FE）变体同时提高了 FVIII 的活性和稳定性 。
- FVIII 基因靶向敲入 iPSCs：成功将野生型（WT）BDD-FVIII 和 FE-FVIII 基因敲入到 HA 患者来源的 iPSCs 的 AAVS1 位点。经过筛选和验证，获得了含有不同 FVIII 变体的 iPSC 细胞系，并证实这些细胞系保持了多能性，且未出现脱靶突变 。
- FVIII 在敲入 iPSC 系中的表达恢复：在敲入 iPSC 系中，FE-FVIII 的表达使得 FVIII 的活性比 WT-KI 系更高。同时，敲入 iPSC 系分化的 ECs 也成功恢复了 FVIII 的表达，且 FE-KI ECs 分泌的 FVIII 比 WT-KI ECs 具有更高的活性和稳定性 。
- 移植 HA 小鼠中 FVIII 表达的恢复：将敲入 FE-FVIII 的 iPSC 分化的 ECs 移植到 HA 小鼠体内，结果显示，小鼠的 FVIII 活性得到恢复，并且在尾巴出血损伤后的存活率提高。在免疫缺陷的 HA 小鼠中，皮下移植的细胞能够长期存活，FVIII 活性在移植后 13 周仍能保持恢复状态 。
研究结论和讨论部分指出，本研究通过将功能增强的 FVIII 基因插入到 iPSCs 的 AAVS1 位点，成功在基因编辑的 iPSCs 及其分化的 ECs 中产生了功能性 FVIII。这一策略不仅提高了 FVIII 的活性和稳定性，还在动物实验中显著改善了 HA 小鼠的症状。此外，该研究为 HA 的治疗提供了一种通用的平台，有望通过相同的 sgRNA 和供体 DNA 盒，对不同 FVIII 突变的患者进行体外细胞治疗。尽管目前研究仍存在一些局限性，如移植细胞在体内的存活时间等问题，但总体而言，这项研究为 HA 的治疗开辟了新的方向，具有重要的临床意义和应用前景，为未来攻克血友病 A 带来了新的曙光。
