高分辨原生质谱揭秘 p53 中半胱氨酸残基抵御 H2O2氧化的关键作用

转录因子 p53 对细胞环境敏感，但 p53-DNA 四聚体复合物感知 H2O2诱导的细胞应激机制不明。研究人员用原生质谱（MS）、离子淌度（IM）-MS 等研究 p53-p21 复合物氧化调控机制，发现 p53 两个半胱氨酸可抵御氧化，为相关研究提供依据。

　　在细胞的微观世界里，转录因子 p53 如同一位 “守护者”，严密调控着细胞周期、DNA 修复和细胞凋亡等重要生命过程。它对细胞环境的变化极为敏感，其中，氧化应激对 p53 的影响一直是科研人员关注的焦点。此前研究表明，氧化应激会削弱 p53 与某些启动子的 DNA 结合亲和力，可具体机制却像一团迷雾，尤其是在生理相关条件下，DNA-p53 四聚体复合物如何感知由 H₂O₂引起的细胞应激，始终没有明确答案。为了揭开这层神秘的面纱，来自英国曼彻斯特生物技术研究所迈克尔?巴伯合作质谱中心以及波兰弗罗茨瓦夫大学化学系的研究人员 Manuel David Peris-Díaz、Artur Kr??el 和 Perdita Barran 开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Chemistry》上，为理解 p53 在氧化应激中的作用机制提供了关键线索。

研究人员采用了多种先进技术来开展这项研究，其中主要包括原生质谱（MS）和离子淌度（IM）-MS 。原生质谱可分析完整蛋白质及其非共价复合物，保留其天然状态；离子淌度质谱则能提供蛋白质的电荷状态分布和碰撞截面等信息，有助于研究蛋白质的构象和动力学。此外，研究中还结合了化学标记和 H₂O₂诱导氧化实验，从多个角度探究 p53-p21 复合物的氧化调控机制。

研究结果

1. p53 在 DNA 结合时的构象变化：通过原生质谱和离子淌度质谱实验发现，p53-DBD（DNA 结合结构域）在无 DNA 时，呈现双峰电荷状态分布，存在紧凑球状和更伸展的两种构象。与 DNA（p21 反应元件）结合后，形成 (Zn-p53)₄DNA 四聚体复合物，单体无序物种减少，p53 单体在结合 DNA 后采取更紧凑的构象。这一结果表明 DNA 结合可诱导 p53 构象改变，使其更稳定，减少与可能抑制其转录功能的伙伴相互作用。
2. (Zn-p53)₄DNA 复合物中反应性半胱氨酸残基的分析：利用原生质谱和 N - 乙基马来酰亚胺（NEM）化学标记对反应性半胱氨酸残基进行分析，发现 p53 单体和与 DNA 结合的 p53 都有两个反应性半胱氨酸残基。通过自上而下和自下而上的质谱方法确定，这两个残基为 Cys182 和 Cys277。其中，Cys277 与 DNA 紧密接触，虽对 p53 功能本身并非关键，但参与了 p53 与 DNA 的部分结合过程。
3. 反应性半胱氨酸对氧化的保护作用研究：研究人员进一步探究 (Zn-p53)₄DNA (p21) 四聚体对 H₂O₂刺激的反应。实验表明，H₂O₂可氧化 p53 中的两个半胱氨酸残基形成亚磺酸中间体，进而与 Zn (II) 结合的半胱氨酸残基反应，导致 Zn (II) 解离和二硫键形成，最终使 p53 从 p21 基因的启动子序列上解离，失去转录活性。不过，在正常细胞条件下，通过氧化还原缓冲剂和金属缓冲剂的作用，失活的 p53 可恢复功能。此外，利用亚磺酸捕获剂二甲基酮和质谱技术验证了反应机制，确定 Cys141 和 Cys182 是 H₂O₂氧化反应中形成亚磺酸的位点。

在研究结论和讨论部分，研究人员明确了 H₂O₂通过 p53 中的半胱氨酸残基调节 DNA - p53 复合物稳定性和活性的机制。这一发现意义重大，它不仅解释了 p53 如何在氧化应激环境中自我调节和保护，还调和了此前相关研究中存在的矛盾数据。尽管研究使用的 H₂O₂浓度高于生理水平，但在相对浓度上与体内情况相符，且捕捉到了不同的氧化机制。该研究为深入理解 p53 在氧化应激相关疾病中的作用奠定了基础，有望为开发针对这些疾病的新疗法提供理论依据，在生命科学和健康医学领域具有重要的潜在应用价值。