新型 OTUD7B 对映选择性片段的发现：开启泛素系统酶靶向治疗新征程

在泛素系统中，去泛素化酶（DUBs）对维持细胞内稳态至关重要，其功能失调与多种疾病相关。为深入探究卵巢肿瘤蛋白酶（OTU）家族 DUBs 的功能及治疗潜力，研究人员开展相关研究，成功发现 OTUD7B 的对映选择性共价片段，为开发靶向抑制剂奠定基础。

　　在生命的微观世界里，细胞如同一个精密运转的工厂，各类蛋白质有条不紊地执行着各自的任务。而泛素系统，就像是工厂里的 “清洁大队” 和 “调控专员”，其中去泛素化酶（DUBs）更是扮演着关键角色。DUBs 专门负责去除蛋白质上的泛素修饰，以此来调控泛素系统的运作。大多数细胞活动都依赖于可逆的泛素化过程，一旦这个过程出现异常，就如同工厂的生产线乱了套，许多疾病便会乘虚而入。

已知的人类 DUBs 大约有 100 种，它们被分为七个不同的亚家族，卵巢肿瘤蛋白酶（OTU）家族便是其中之一。OTU 家族成员众多，具有不同的泛素链切割特异性，并且在免疫反应调节和癌症发生发展中起着重要作用 。例如，OTUD7B 能特异性切割 K11 连接的多聚泛素链，还参与了雌激素受体 α（ERα）和 GβL（mTOR 复合物的一个亚基）的去泛素化过程，促进肿瘤的发生。然而，目前针对 OTU 家族 DUBs 的研究面临着重重困难，其中最突出的问题就是缺乏特异性的工具化合物，这使得深入探究它们在细胞中的功能以及评估其治疗潜力变得异常艰难。

为了解决这些难题，来自英国弗朗西斯?克里克研究所（The Francis Crick Institute）和葛兰素史克（GSK）的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们致力于寻找针对 OTU DUBs 的新型工具化合物，最终成功发现了 OTUD7B 的对映选择性共价片段，这一成果发表在《Communications Chemistry》杂志上。这一发现为开发更有效的 OTUD7B 靶向抑制剂提供了重要的起点，有望为相关疾病的治疗开辟新的道路。

在这项研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是化学蛋白质组学技术，通过竞争性基于活性的蛋白质谱（ABPP），使用生物素化的泛素乙烯砜（Biotin-Ahx-Ub-VS）探针来富集泛素结合蛋白，从而筛选与 DUBs 相互作用的片段；其次是高通量化学直接生物学优化（HTCD2B）技术，通过一步酰胺偶联反应快速生成和筛选相关片段，以优化初始片段命中物。此外，还利用了完整蛋白质液相色谱 - 质谱（LC-MS）、酶活性荧光生化底物测定、位点鉴定（SiteID）实验以及共价分子对接等技术，从不同角度对筛选得到的片段进行验证和表征。

研究结果

1. 片段筛选：研究人员利用优化后的高通量化学蛋白质组学平台，对 227 种半胱氨酸反应性氯乙酰胺片段进行筛选，这些片段具有丰富的化学多样性，旨在覆盖更广泛的化学空间。最终在 43 种 DUBs 中，发现了针对 32 种 DUBs 的命中片段，涵盖了 MJD、OTU、UCH 和 USP 亚家族 。并且大多数片段（63%）形成了选择性相互作用，只有少数片段（5%）具有高度混杂性。研究人员进一步将注意力聚焦在 OTU DUB 家族，量化了其中大部分具有催化半胱氨酸的成员，发现了针对 9 种 OTU DUBs 的片段命中物。
2. 体外验证与优化：基于平均 log_z比、脱靶 DUB 蛋白数量以及化学结构是否适合高通量化学等标准，研究人员挑选了 7 个片段，针对 OTUD4、OTUD5、OTUD7A、OTUD7B 和 ZRANB1 这 5 种 OTU 家族蛋白进行体外验证和优化。通过完整蛋白质 LC-MS 对重组 OTUs 进行标记测量，结果显示大部分片段在体外的标记情况与化学蛋白质组学筛选结果相符，但 OTUD7A 在两种技术中的结果存在一定差异，这可能暗示其催化半胱氨酸在细胞环境中受到某种未知因素的调节。
3. HTC-D2B 筛选：为了快速优化化合物，研究人员运用 HTC-D2B 平台，围绕 7 个初始片段命中物设计了一个包含 351 种胺的库，通过原位高通量化学（HTC）反应生成了 351 种半胱氨酸反应性氯乙酰胺片段的二级库。经过 LC-MS 分析转化率并进行试剂淬灭（部分蛋白不适用）后，将该库与 5 种重组 OTU DUBs 进行孵育，通过完整蛋白质 LC-MS 测量蛋白标记情况。结果发现，与第一轮验证的片段相比，OTUD7B 和 ZRANB1 的标记有显著改善，OTUD4 和 OTUD7A 也有一些改进，但 OTUD5 没有明显变化。基于这些结果，研究人员挑选了 21 种化合物进行进一步验证和蛋白质组学选择性研究。
4. 对映选择性验证：在第二轮化学蛋白质组学分析中，研究人员发现化合物 28 对 OTUD7B 的标记效果优于其母体片段 2 和 6，且具有良好的选择性。由于 28 是外消旋化合物，研究人员对其两种对映体（29 和 30）进行了深入研究。浓度响应化学蛋白质组学实验证实，活性 S - 对映体（29）对 OTUD7B 具有对映选择性靶向作用，其 TE₅₀（50% 靶标结合所需浓度）为 3.8 μM，比活性较低的 R - 对映体（30，TE₅₀=50.5 μM）活性高约 13 倍 。此外，化合物 29 对 OTUD7B 的选择性比对 OTUD4 高约 8 倍，对其他 DUBs 的选择性更高。生化活性测定和动力学表征也进一步证实了化合物 29 的对映选择性，其 IC₅₀为 3.5 μM，k_inact/K_I为 5.5±0.1 M^-1 s^-1，分别比化合物 30 高约 17 倍和 37 倍 。
5. 作用位点与结构分析：通过 SiteID 实验，研究人员确认化合物 29 在 OTUD7B 上的共价标记位点为催化半胱氨酸 Cys194。为了深入理解 S - 对映体 29 比 R - 对映体 30 活性更高的原因，研究人员进行了共价分子对接，但由于结晶失败，无法通过晶体结构直接观察。对接结果预测两种对映体在结合时存在 180° 的构象翻转，这改变了亲电酰胺和芳香环在口袋中的位置，但在结合位点形成的相互作用类型上没有明显差异。

研究结论与讨论

研究人员成功提高了高通量化学蛋白质组学平台的通量，从 227 种氯乙酰胺片段中筛选出针对多个 DUB 亚家族的命中片段，并针对 OTU 亚家族进行了深入研究。通过 HTC-D2B 筛选，发现了对 OTUD7B 具有对映选择性抑制作用的化合物 29，这是首次使用氯乙酰胺亲电试剂抑制 OTUD7B，代表了一种新型药效团。尽管化合物 29 分子复杂度较低、亲和力有限，但在生物学相关条件下对 OTUD7B 具有选择性标记作用。这一发现为药物化学进一步优化开发更有效、更具选择性的 OTUD7B 抑制剂提供了理想的起点，尤其是考虑到 OTUD7B 的 X 射线晶体结构已可用，这将极大地促进后续的药物设计工作。OTUD7B 参与多种关键蛋白的去泛素化过程，其抑制剂的开发对于治疗相关癌症等疾病具有重要的潜在价值，有望为未来的精准治疗带来新的希望。